Caratterizzazione biochimica e biofisica di nuovi inibitori dell'interazione proteina-proteina - studio del fattore di trascrizione TEAD e dell'enzima timidilato sintasi

Uno dei principali problemi legati al trattamento delle neoplasie è la farmacoresistenza, che rende necessario lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. In questo contesto, strategie dirette allo studio di inibitori delle funzioni proteiche che interferiscono con l’interazione proteina-proteina sono ampiamente studiate e rappresentano studi avanzati di grande attualità. I fattori di trascrizione TEAD e l’enzima timidilato sintasi (TS) rappresentano interessanti bersagli molecolari. hTEAD è coinvolto nella via di segnalazione Hippo e nella regolazione della proliferazione e progressione tumorale; la disregolazione dell’interazione di hTEAD con i cofattori YAP/TAZ è associata allo sviluppo di neoplasie. La timidilato sintasi è invece essenziale per la proliferazione cellulare, poiché catalizza una reazione fondamentale per la sintesi de novo di dTMP, necessario per la sintesi del DNA. Per lo studio di hTEAD4 sono stati progettati inibitori capaci di interferire con l’interazione YAP-TEAD a livello dell’interfaccia 3, uno dei principali siti di contatto tra le due proteine. La loro attività è stata valutata mediante un saggio fluorimetrico di spiazzamento basato sul peptide P6-TER, mimetico della porzione di YAP coinvolta nel legame con TEAD e funzionalizzato con tetraetilrodammina (TER). L’interazione tra il dominio YBD di TEAD e P6-TER è stata caratterizzata mediante lo studio dell’anisotropia di fluorescenza, determinando una costante di dissociazione pari a 259 ± 80 nM. Il complesso hTEAD-P6-TER è stato quindi utilizzato per valutare la capacità dei composti di competere con il peptide per il legame a hTEAD4. Per hTS sono stati studiati composti progettati per interferire con la struttura omodimerica dell’enzima, distinguendosi dagli inibitori classici diretti al sito catalitico. L’interazione è stata analizzata mediante studi cinetici, saggi FRET e Photoaffinity Labeling (PAL), al fine di valutarne l’effetto sull’attività enzimatica, la capacità di indurre la dissociazione del dimero e la modalità di interazione con il bersaglio. I risultati ottenuti per hTEAD hanno evidenziato alcuni elementi strutturali rilevanti per l’attività dei composti della serie PM. Questi composti legano la proteina TEAD con valori di IC50 inferiori a 20 M, supportandone il potenziale biologico. Per hTS, il composto TSI_C7a106 ha mostrato un valore di Ki pari a 1.14 M e un valore di IC50 pari a 9.39 M, indicativi di una buona capacità inibitoria, sebbene la presenza del gruppo nitro rappresenti un elemento da considerare negli studi futuri. I saggi FRET hanno identificato TSI_C7a12, TSI_C7a13, TSI_C7a17, e TSI_C7a20 come composti caratterizzati da un comportamento favorevole. Tra i composti della serie D, A40, E7, D46, D47, D49 e D52 hanno mostrato un comportamento dissociativo nei confronti del dimero di hTS, con costanti di dissociazione nel basso intervallo micromolare. I risultati di PAL ottenuti per A40 hanno confermato i dati di docking molecolare, supportando la modalità di interazione prevista con hTS. Nel complesso, il lavoro ha permesso di caratterizzare nuovi approcci di targeting diretti verso due differenti bersagli molecolari coinvolti nella progressione tumorale, integrando metodologie biofisiche e funzionali per lo studio delle interazioni ligando-target. I risultati contribuiscono alla valutazione di nuove strategie farmacologiche potenzialmente utili al superamento della farmacoresistenza associata ai trattamenti antitumorali convenzionali.