Lipidomic and metabolomic signatures of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) by UHPLC-HRMS analysis: identification of potential plasmatic biomarkers for disease stratification and progression

La malattia epatica steatosica associata a disfunzione metabolica (MASLD) è attualmente riconosciuta come la principale causa di malattia epatica cronica. Essa è caratterizzata da un accumulo di trigliceridi superiore al 5% negli epatociti, in presenza di almeno un fattore di rischio cardiometabolico. La MASLD comprende uno spettro di condizioni cliniche che va dalla steatosi epatica isolata, alla steatoepatite associata a disfunzione metabolica (MASH). Sebbene queste due fasi iniziali della malattia siano potenzialmente reversibili attraverso modifiche dello stile di vita e un'adeguata alimentazione, la progressione della fibrosi può condurre allo sviluppo di cirrosi e carcinoma epatocellulare, fino a rendere necessario il trapianto epatico. Attualmente, uno dei principali ostacoli nella gestione della MASLD è rappresentato dalle limitazioni delle metodiche diagnostiche disponibili. L’ecografia presenta specificità e accuratezza limitate nella rilevazione della steatosi, mentre la biopsia epatica, gold standard per la diagnosi di steatoepatite associata a disfunzione metabolica (MASH) e la valutazione della fibrosi, è una procedura invasiva, costosa e associata al rischio di complicanze. Per superare le attuali criticità diagnostiche, questo progetto di ricerca ha l’obiettivo di caratterizzare i profili lipidici e metabolici plasmatici di pazienti affetti da MASLD a diversi stadi della malattia, al fine di identificare alterazioni qualitative e quantitative utili allo sviluppo di approcci diagnostici più accurati e meno invasivi. I lipidi e i metaboliti sono stati estratti dai campioni di plasma mediante una procedura di estrazione con solventi metanolo e methyl-tert-butyl etere (MTBE) e successivamente sottoposti ad analisi mediante UHPLC-HRMS con analizzatore Orbitrap Q-Exactive. L’identificazione e annotazione delle specie lipidiche e dei metaboliti è stata condotta con i software MS-DIAL e Compound Discoverer, rispettivamente. Le analisi lipidomica e metabolomica hanno permesso di discriminare i soggetti sani dai pazienti affetti da MASLD. In particolare, nelle fasi iniziali della malattia, la discriminazione tra i gruppi è risultata principalmente associata all’aumento di trigliceridi e acidi grassi liberi, ad alterazioni significative delle vie metaboliche coinvolte nella sintesi e degradazione degli aminoacidi a catena ramificata (BCAA) e all’aumento dei livelli di sette acilcarnitine. Nel confronto tra pazienti con e senza MASH e tra pazienti con MASH a rischio di progressione e pazienti senza evidenza di progressione, l’analisi lipidomica ha evidenziato un significativo aumento di trigliceridi, fosfatidilcoline e fosfatidiletanolamine e una riduzione dei fosfolipidi eterei. Un’altra importante osservazione riguarda la riduzione delle HexCer, risultata statisticamente significativa esclusivamente nella stratificazione in base al grado di fibrosi. Al contrario, l’analisi metabolomica degli stadi più avanzati della patologia non ha invece evidenziato vie metaboliche significativamente arricchite. Nel complesso, questi risultati suggeriscono un ruolo potenzialmente più rilevante del metabolismo lipidico rispetto al profilo metabolico globale nella patogenesi della MASH. L’integrazione dei dati lipidomici e metabolomici ottenuti da ulteriori matrici biologiche potrebbe consentire una caratterizzazione più completa delle alterazioni metaboliche associate alla MASLD e contribuire all’identificazione di nuovi biomarcatori utili per la diagnosi e il monitoraggio della progressione della malattia.

Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) is recognized as the most common cause of chronic liver disease. It is characterized by hepatic steatosis involving more than 5% of hepatocytes in the presence of at least one cardiometabolic risk factor. MASLD encompasses a spectrum of conditions, ranging from isolated steatosis, known as metabolic dysfunction-associated steatotic liver (MASL), to metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH), characterized by hepatic steatosis, lobular inflammation, and hepatocellular ballooning, with or without fibrosis. While these two stages of the disease may be reversible through lifestyle modifications and a healthy diet, progressive fibrosis can ultimately lead to cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC), potentially requiring liver transplantation. Currently, the bottleneck in managing the disease is related to limited diagnostic tools. Imaging methods, such as ultrasound, which identifies triglyceride accumulation in hepatocytes, are not specific and accurate techniques for the detection of steatosis. Another major challenge is the diagnosis of metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Currently, liver biopsy remains the gold standard for assessing liver histopathology, determining the degree of fibrosis, and evaluating disease severity. However, its routine clinical use is limited by its invasive nature, high cost, and risk of procedure-related complications. To overcome these current diagnostic issues, this research project aimed to characterize the plasma lipidomic and metabolic profiles of patients at different stages of MASLD, with the goal of identifying qualitative and quantitative alterations that could support the development of more accurate and less invasive diagnostic approaches. Lipids and metabolites were extracted from plasma using a methanol - methyl-tert-butyl ether (MTBE) extraction and analyzed by UHPLC coupled to an Orbitrap Q-Exactive mass spectrometer. Lipid and metabolite annotation and identification were performed using MS-DIAL and Compound Discoverer software, respectively. Both lipidomic and metabolomic analyses were able to discriminate between control subjects and patients with MASLD. In the early stages of the disease, group discrimination was mainly driven by increased triglycerides and free fatty acids, significant alterations in pathways involved in branched-chain amino acid (BCAA) synthesis and degradation, and the upregulation of seven acylcarnitine. In the comparison between MASH and non-MASH patients, as well as between MASH patients at risk of disease progression and those without evidence of progression, lipidomic analysis revealed a significant upregulation of triglycerides, phosphatidylcholines, and phosphatidylethanolamines, whereas downregulated lipids mainly belonged to the class of ether-linked phospholipids. Another important finding was the downregulation of HexCer, which reached statistical significance only when groups were stratified according to fibrosis stage. In contrast, metabolomic analysis of patients at more advanced disease stages did not identify significantly enriched metabolic pathways. These results may suggest a greater importance and central role of lipid metabolism over metabolic profile in the pathogenesis of MASH. Future integration of lipidomic and metabolomic data from additional biological matrices could provide a more comprehensive characterization of the metabolic alterations underlying MASLD.