La fibrosi è caratterizzata da un’abnorme secrezione di matrice extracellulare, che determina una progressiva riduzione dell’elasticità dell’organo interessato. In assenza di trattamenti terapeutici efficaci, viene trapiantato il tessuto adiposo autologo, (autologous fat transfer AFT). La tesi mira a chiarire il ruolo antifibrotico di AFT mediante uno studio ex-vivo e in-vitro. La microarchitettura tessutale di biopsie cutanee raccolte da 14 pazienti affetti da sclerodermia è stata analizzata prima e dopo il trattamento con AFT. Le immagini ottenute da colorazione con Picrosirius Red sono state quantificate con software di analisi di immagine (Zen Pro, Zeiss). Parallelamente, sono state isolate CSM da tessuto adiposo e coltivate sia in condizione standard di coltura 2D e in sistema 3D tramite lo stampaggio con Bioplotter (EnvisionTec) e somministrate a un modello in vitro che ricapitola la fibrosi in tre configurazioni: 2D) CSM seminate a contatto diretto con il modello fibrotico; 3D) MSC biostampante in 3D a contatto con il modello; S) surnatante del modello 3D per valutare l'effetto esclusivo delle vescicole/molecole secrete. L’effetto del trattamento è stato osservato a 3, 6 e 9 giorni previa cambio terreno e/o surnatante fresco ogni 3 giorni. Per valutare il rimodellamento della matrice, gli scaffold fibrotici sono stati analizzati tramite immunofluorescenza per fibronectina (FN), colorazione Tricromica di Masson (collagene), microscopia elettronica a scansione (SEM) e misurazione del diametro come indice del livello di contrazione del modello fibrotico. Il risultato dell’analisi ex vivo ha permesso di evidenziare un valore medio di percentuale di area occupata dalle fibre rosse pari a 2,95±0,6 e 5,52±1,34 µm2 rispettivamente prima e dopo il trattamento nella zona periorale. Il valore medio di area occupata dalle fibre verdi risulta essere 7,40±0,86 e 9,79±1,46 µm2 rispettivamente prima e dopo il trattamento nella zona periorale. L’analisi nella biopsia raccolta dalla mano ha portato un trend similare. Il trattamento con AFT non è associato a un cambiamento della microarchitettura tessutale, nonostante i miglioramenti clinici dei pazienti. Per comprendere meglio il ruolo antifibrotico delle CSM, è stata eseguita l’indagine in-vitro. A livello macroscopico solo il trattamento 3D mostra una riduzione statisticamente significativa della contrazione dopo 3 giorni dal trattamento, con valori medi 7190± 189 um per il 3D contro 6023±182 per il campione fibrotico (p-value<0,01). Analizzando l’architettura tessutale, tramite l’immunofluorescenza con FN e con SEM si è osservata la presenza di noduli a 3 giorni senza evidenziare alcuna differenza tra trattati con il campione fibrotico. Nelle tempistiche successive si osserva un rimodellamento della matrice caratterizzata da un elevata intensità di fluorescenza e una matrice molto compatta al SEM in tutti i casi tranne quello trattato con 3D. L’indagine con la tricromica di Masson, che marca in blu le fibre di collagene, conferma questa osservazione mostrando un’intensità di segnale blu ridotta nel campione trattato con 3D. La quantificazione dell’immagine riporta una riduzione statisticamente significativa rispetto al campione fibrotico in tutti le tempistiche osservate. I risultati mostrano che le tre modalità di somministrazione delle CSM determinano effetti differenti sul modello di fibrosi, nel quale è possibile studiare l’interazione CSM–fibroblasto/ECM, evidenziando un effetto antifibrotico più marcato nel trattamento 3D. Questi risultati suggeriscono che, nel modello ex vivo, in cui le CSM sono presenti all’interno del tessuto adiposo, il beneficio clinico possa essere maggiormente associato alla loro attività antinfiammatoria piuttosto che a un’azione diretta sul rimodellamento della matrice extracellulare.
Fibrosis is characterized by abnormal extracellular matrix deposition, resulting in a progressive loss of elasticity of the affected organ. In the absence of effective therapeutic treatments, autologous fat transfer (AFT) is increasingly used as an alternative therapeutic approach. This thesis aims to investigate the antifibrotic role of AFT through an ex vivo and in vitro study. The tissue microarchitecture of skin biopsies collected from 14 patients affected by scleroderma was analyzed before and after AFT treatment. Images obtained by Picrosirius Red staining were quantified using image analysis software (ZEN Pro, Zeiss). In parallel, mesenchymal stromal cells (MSCs) were isolated from adipose tissue and cultured under standard 2D conditions and in a 3D system using bioprinting technology (Bioplotter, EnvisionTEC). MSCs were subsequently administered to an in vitro model recapitulating fibrosis according to three configurations: 2D, consisting of MSCs seeded in direct contact with the fibrotic model; 3D, consisting of bioprinted MSCs in direct contact with the fibrotic model; and S, consisting of supernatant collected from the 3D MSC construct, to investigate the effect of soluble factors and extracellular vesicles released by MSCs. The effects of the treatments were evaluated after 3, 6, and 9 days, with culture medium and/or fresh supernatant replaced every 3 days. To evaluate extracellular matrix remodeling, the fibrotic scaffolds were analyzed by fibronectin (FN) immunofluorescence, Masson's trichrome staining for collagen, scanning electron microscopy (SEM), and diameter measurements as an index of model contraction. The ex vivo analysis showed a mean percentage of area occupied by red fibers of 2.95 ± 0.60 and 5.52 ± 1.34 µm2 before and after treatment, respectively, in the perioral region. The mean area occupied by green fibers was 7.40 ± 0.86 and 9.79 ± 1.46 µm2 before and after treatment, respectively. Analysis of biopsies collected from the hand showed a similar trend. AFT treatment was not associated with significant changes in tissue microarchitecture, despite the clinical improvement observed in the patients. To further investigate the antifibrotic role of MSCs, an in vitro study was therefore performed. At the macroscopic level, only the 3D treatment resulted in a statistically significant reduction in model contraction after 3 days of treatment, with mean diameters of 7190 ± 189 µm for the 3D-treated samples compared with 6023 ± 182 µm for the untreated fibrotic samples (p < 0.01). Analysis of tissue architecture by FN immunofluorescence and SEM revealed the presence of nodules after 3 days, with no evident differences between treated and untreated fibrotic samples. At later time points, progressive matrix remodeling was observed, characterized by increased fluorescence intensity and a highly compact matrix at SEM in all conditions except the 3D-treated samples. Masson's trichrome staining, which labels collagen fibers in blue, confirmed these findings, showing a reduced blue signal intensity in the 3D-treated samples. Image quantification showed a statistically significant reduction compared with the fibrotic control at all time points analyzed. Overall, the results show that the three MSC administration modalities induce distinct effects on the fibrotic model, which allows the interaction between MSCs and fibroblasts/extracellular matrix to be investigated. The 3D treatment showed the most pronounced antifibrotic effect. These findings suggest that, in the ex vivo model, where MSCs are administered within adipose tissue, the clinical benefit of AFT may be more strongly associated with the anti-inflammatory activity of MSCs than with a direct effect on extracellular matrix remodeling.
The role of Mesenchymal Stromal Cell in the treatment of Scleroderma: A preliminary study
DI VIZIO, MARTINA
2025/2026
Abstract
La fibrosi è caratterizzata da un’abnorme secrezione di matrice extracellulare, che determina una progressiva riduzione dell’elasticità dell’organo interessato. In assenza di trattamenti terapeutici efficaci, viene trapiantato il tessuto adiposo autologo, (autologous fat transfer AFT). La tesi mira a chiarire il ruolo antifibrotico di AFT mediante uno studio ex-vivo e in-vitro. La microarchitettura tessutale di biopsie cutanee raccolte da 14 pazienti affetti da sclerodermia è stata analizzata prima e dopo il trattamento con AFT. Le immagini ottenute da colorazione con Picrosirius Red sono state quantificate con software di analisi di immagine (Zen Pro, Zeiss). Parallelamente, sono state isolate CSM da tessuto adiposo e coltivate sia in condizione standard di coltura 2D e in sistema 3D tramite lo stampaggio con Bioplotter (EnvisionTec) e somministrate a un modello in vitro che ricapitola la fibrosi in tre configurazioni: 2D) CSM seminate a contatto diretto con il modello fibrotico; 3D) MSC biostampante in 3D a contatto con il modello; S) surnatante del modello 3D per valutare l'effetto esclusivo delle vescicole/molecole secrete. L’effetto del trattamento è stato osservato a 3, 6 e 9 giorni previa cambio terreno e/o surnatante fresco ogni 3 giorni. Per valutare il rimodellamento della matrice, gli scaffold fibrotici sono stati analizzati tramite immunofluorescenza per fibronectina (FN), colorazione Tricromica di Masson (collagene), microscopia elettronica a scansione (SEM) e misurazione del diametro come indice del livello di contrazione del modello fibrotico. Il risultato dell’analisi ex vivo ha permesso di evidenziare un valore medio di percentuale di area occupata dalle fibre rosse pari a 2,95±0,6 e 5,52±1,34 µm2 rispettivamente prima e dopo il trattamento nella zona periorale. Il valore medio di area occupata dalle fibre verdi risulta essere 7,40±0,86 e 9,79±1,46 µm2 rispettivamente prima e dopo il trattamento nella zona periorale. L’analisi nella biopsia raccolta dalla mano ha portato un trend similare. Il trattamento con AFT non è associato a un cambiamento della microarchitettura tessutale, nonostante i miglioramenti clinici dei pazienti. Per comprendere meglio il ruolo antifibrotico delle CSM, è stata eseguita l’indagine in-vitro. A livello macroscopico solo il trattamento 3D mostra una riduzione statisticamente significativa della contrazione dopo 3 giorni dal trattamento, con valori medi 7190± 189 um per il 3D contro 6023±182 per il campione fibrotico (p-value<0,01). Analizzando l’architettura tessutale, tramite l’immunofluorescenza con FN e con SEM si è osservata la presenza di noduli a 3 giorni senza evidenziare alcuna differenza tra trattati con il campione fibrotico. Nelle tempistiche successive si osserva un rimodellamento della matrice caratterizzata da un elevata intensità di fluorescenza e una matrice molto compatta al SEM in tutti i casi tranne quello trattato con 3D. L’indagine con la tricromica di Masson, che marca in blu le fibre di collagene, conferma questa osservazione mostrando un’intensità di segnale blu ridotta nel campione trattato con 3D. La quantificazione dell’immagine riporta una riduzione statisticamente significativa rispetto al campione fibrotico in tutti le tempistiche osservate. I risultati mostrano che le tre modalità di somministrazione delle CSM determinano effetti differenti sul modello di fibrosi, nel quale è possibile studiare l’interazione CSM–fibroblasto/ECM, evidenziando un effetto antifibrotico più marcato nel trattamento 3D. Questi risultati suggeriscono che, nel modello ex vivo, in cui le CSM sono presenti all’interno del tessuto adiposo, il beneficio clinico possa essere maggiormente associato alla loro attività antinfiammatoria piuttosto che a un’azione diretta sul rimodellamento della matrice extracellulare.| File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.14251/10285