Impiego della tecnologia HD-MEA per l'identificazione di attività ictal-like in fette ex vivo di roditore e tessuto umano

Il presente lavoro di tesi è finalizzato a testare l’utilizzo della tecnologia HD-MEA (high-density Microelectrode Array) per l’identificazione e caratterizzazione dell’attività ictal-like in fettine di tessuto cerebrale acuto. Il dispositivo HD-MEA è un sistema di acquisizione dell’attività elettrofisiologica extracellulare basato su tecnologia C-MOSFET a 4096 canali. Lo studio si è inizialmente focalizzato sull’ottimizzazione dei protocolli di acquisizione ed analisi dei segnali elettrofisiologici ottenuti da campioni murini al fine di utilizzare la tecnologia su fettine acute di tessuto umano proveniente da campioni chirurgici. Le indagini sono state condotte su preparati di ippocampo mantenuti vitali grazie a protocolli sperimentali ottimizzati per aumentare il tempo di sopravvivenza post-espianto. L’attività elettrica dei circuiti ippocampali è stata caratteristica mediante l’utilizzo di protocolli farmacologici in grado di indurre una condizione di ipereccitabilità generalizzata simile alle attività ictale ed inter-ictale tipiche delle manifestazioni epilettiche. L’analisi delle acquisizioni elettrofisiologiche è stata condotta mediante protocolli appositamente sviluppati in grado di rilevare automaticamente la presenza di attività sincrona e diffusa (population burst) e tracciarne l’evoluzione spazio-temporale. L’analisi ha mostrato come la rimozione del blocco voltaggio-dipendente dei recettori glutammatergici di tipo NMDA, ottenuta attraverso la rimozione del Mg2+ dall’ambiente extracellulare e la contestuale applicazione di un bloccante selettivo per i recettori GABAergici, induca una variazione dell’attività di rete. Globalmente l’aumento del numero di elettrodi attivi suggerisce un incremento dell’attività di rete tramite il reclutamento di nuove popolazioni di neuroni, mentre la sincronizzazione della rete è confermata dalla comparsa di population bursts. Queste dinamiche sono simili alle manifestazioni ictali che si osservano durante stati di sincronizzazione patologica dei circuiti neurali che si osservano durante crisi epilettiche dovute ad aumentata eccitabilità generalizzata ed alla mancata azione dei circuiti inibitori. Questi risultati consentono di dimostrare come la tecnologia HD-MEA sia uno strumento efficiente per monitorare l’attività di reti neuronali intatte con elevata risoluzione spaziale e temporale fornendo un valido strumento per l’analisi fisiopatologica dei circuiti nervosi. Il processamento del segnale ha previsto innanzitutto una fase dell’estrazione dei singoli potenziali d'azione, e successivamente una fase di noise detection per l'esclusione spazio-temporale del rumore di fondo e degli artefatti, tramite ispezione visiva. Per l’identificazione quantitativa degli eventi sincroni di popolazione l’attività è stata integrata in uno Spike-Time Histogram (STH), facilitandone la computazione ed analisi matematica. L'analisi dimostra che il protocollo farmacologico utilizzato altera le dinamiche di rete. Nello specifico, la rimozione del blocco voltaggio-dipendente dei recettori NMDA, indotta dalla perfusione della soluzione 0Mg2+-aCSF e la disinibizione GABAergica indotta dalla gabazina aumentano il numero di elettrodi attivi e provocano profondi cambiamenti nei pattern di attività, determinando la comparsa di intensi population burst. Questa peculiare dinamica elettrofisiologica si può attribuire a transizioni simili a quelle ictali, portando ad una sincronizzazione patologica: si osserva un aumento dei potenziali d’azione registrati, fino a superare i 3.000 eventi registrati, coinvolgendo simultaneamente numerosi elettrodi dell’array a causa del temporaneo fallimento dei sistemi inibitori. In conclusione, il proof-of-concept finale consente di dimostrare la robustezza dell’assetto sperimentale e l’enorme potenziale della tecnologia HD-MEA