Bioconversione dello xilosio in xilitolo mediante Pichia fermentans WC 1507 : impiego della mutagenesi UV e chimica per migliorare la tolleranza al furfurale.

Le biomasse lignocellulosiche rappresentano una fonte di carbonio abbondante e rinnovabile, non in competizione con la filiera alimentare e ricca di zuccheri recuperabili e valorizzabili per via biotecnologica. Tra i metodi di frazionamento, il pretrattamento organosolv permette di separare l’emicellulosa dalle altre componenti e fornisce una frazione liquida, il black liquor, ricca di xilosio. Questa matrice contiene però composti inibitori, come furfurale, 5-idrossimetil-furfurale (5-HMF) e acido acetico, che ne limitano l’impiego come substrato di fermentazione. Lo xilosio può essere convertito in xilitolo, un poliolo dolcificante di interesse alimentare e farmaceutico. Pichia fermentans WC 1507, lievito non patogeno a rapida crescita, si è dimostrato un efficiente bioconvertitore: in terreno con 120 g/L di xilosio puro ha prodotto circa 60 g/L di xilitolo. Il ceppo risulta tuttavia inibito nel black liquor, sul quale non è stato in grado né di crescere né di produrre xilitolo. Lo scopo di questa tesi è stato quindi studiare l’effetto degli inibitori sulla vitalità e sulla produzione di xilitolo e ottenere, mediante mutagenesi casuale, mutanti capaci di produrre xilitolo anche in presenza di furfurale. Le prove di minima concentrazione inibente hanno mostrato che furfurale e 5-HMF allungano la fase lag e riducono la crescita in modo dose-dipendente. Una concentrazione di 1 g/L di furfurale, pur ancora permissiva per la crescita, ha ridotto la produzione di xilitolo a circa un sesto rispetto al controllo: la tolleranza all’inibitore non coincide quindi con la capacità di bioconversione, in accordo con l’ipotesi che il potere riducente venga in parte dirottato verso la detossificazione del furfurale. Il ceppo ha inoltre trasformato completamente il furfurale nelle prime 24 ore, presumibilmente in acido 2-furoico, la cui identificazione è in corso. In assenza di strumenti genetici per il miglioramento mirato, il ceppo è stato sottoposto a mutagenesi casuale, prima mediante irraggiamento UV e poi con etil-metansulfonato (EMS). Dalle circa 200 colonie isolate dopo mutagenesi UV, attraverso screening in piastra multipozzetto, in tubo e per diluizioni su piastra Petri, sono stati selezionati 13 mutanti con crescita migliore del wild-type in presenza di 2 g/L di furfurale. Sono quindi state effettuate prove di produzione con tali ceppi selezionati: in assenza dell’inibitore alcuni mutanti hanno mostrato una crescita migliore e, in alcuni casi, anche una maggiore produzione di xilitolo. In presenza di furfurale, invece, il miglioramento della crescita non si è tradotto in un aumento della produzione di xilitolo rispetto ai 9.8 g/L del ceppo parentale. Il ceppo P8-12, scelto tra i mutanti perché risulta quello con la crescita più rapida in presenza di furfurale, è stato sottoposto a mutagenesi chimica con EMS, da cui sono stati selezionati 8 ceppi di interesse, la cui caratterizzazione è tuttora in corso. Pur non avendo ancora selezionato mutanti con produttività migliorata in presenza di furfurale, il lavoro ha definito un percorso sperimentale completo di mutagenesi e screening. Le prospettive prevedono la rivalutazione degli 8 ceppi, l’analisi dei metaboliti del furfurale e, se necessario, strategie complementari come la detossificazione del black liquor o l’adattamento del lievito all’inibitore.