Analisi Del Profilo Trascrittomico Dei Monociti Come Potenziali Biomarcatori Nelle Vasculiti Dei Grandi Vasi

L’arterite a cellule giganti (GCA) è una vasculite granulomatosa che coinvolge le arterie di grosso e medio calibro, in cui i monociti hanno un ruolo chiave nelle prime fasi dell’insorgenza. La terapia standard è basata sull'utilizzo di glucocorticoidi (GC) per lungo periodo. Recentemente è stato adottato un protocollo terapeutico che prevede la riduzione del GC a soli 3 giorni con boli endovena seguiti da terapia biologica anti-IL-6R. Lo studio si è proposto di valutare le alterazioni indotte in vivo da boli di GC in pazienti con GCA, per contribuire alla comprensione dei meccanismi d’azione e identificare potenziali biomarcatori di risposta terapeutica. Sono stati arruolati 11 pazienti con GCA in fase attiva di malattia, sottoposti a prelievo ematico prima (T0) e dopo il trattamento con 3 boli di 500 mg di metilprednisolone endovena per 3 giorni consecutivi (PB). I monociti sono stati isolati dalle cellule mononucleate del sangue periferico a T0 e PB. Le percentuali delle sottopopolazioni monociatrie sono state analizzate mediante citofluorimetria, mentre l’RNA è stato estratto e utilizzato per la preparazione delle librerie per il sequenziamento. L'analisi iniziale dei dati grezzi ha compreso la verifica della qualità, il trimming delle sequenze e l'allineamento al genoma umano di riferimento. I dati sono stati analizzati con R usando i pacchetti DESeq2 (espressione differenziale), PCAtools (analisi delle componenti principali-PCA), UCell (score delle signature geniche), DoRothEA/VIPER (attività dei fattori di trascrizione). L'analisi di arricchimento funzionale è stata eseguita mediante PANTHER e GSEA. Il trattamento con GC ha indotto una marcata riduzione dei monociti CD16-positivi, con popolazione PB quasi solo classica. La PCA ha mostrato che la prima componente spiega il 30% della varianza totale ed è significativamente associata al trattamento. Il clustering gerarchico non supervisionato ha identificato due gruppi distinti riconducibili a T0 e PB. L'analisi DESeq2 ha identificato 328 geni sovraespressi e 323 sottoespressi nei monociti PB rispetto al T0; il confronto con Human Protein Atlas ha mostrato che solo 71 geni down-regolati sono specifici dei subset intermedi/non classici, indicando che la down-regolazione non è attribuibile solo alla variazione di composizione monocitaria. Tra i pathway deregolati sono emersi la riduzione di fagocitosi e presentazione antigenica via MHC I e II. Il trattamento ha aumentato l’espressione dei geni legati alla signature “risposta cellulare allo stimolo con glucocorticoidi” in modo differente tra i pazienti e non correlato alle caratteristiche cliniche. L’analisi dei fattori di trascrizione coinvolti nella deregolazione dell’espressione genica indotta dal trattamento ha evidenziato che 10 fattori di trascrizione erano alterati in termini di livelli di espressione e di attività. Il confronto con un dataset di single cell RNAseq che confronta i geni deregolati nei monociti dei pazienti GCA rispetto a soggetti di controllo, ha evidenziato che degli 85 geni deregolati nella GCA solo 8 vengono modulati dal trattamento. Il confronto con i geni deregolati nelle arterie temporali infiammate di pazienti GCA, ha evidenziato 191 geni che potrebbero essere bersagli della terapia con boli di GC nelle arterie. Il trattamento con boli di GC induce sia una redistribuzione delle sottopopolazioni monocitarie, sia un profondo rimodellamento del profilo trascrizionale dei monociti circolanti, che coinvolge fattori di trascrizione ulteriori rispetto alla sola via del recettore dei glucocorticoidi. Tuttavia, questi cambiamenti non risultano selettivi per i meccanismi molecolari alterati nella GCA, ma riflettono piuttosto un'azione ad ampio spettro.