Nuovi inibitori a lipofilia controllata dell'enzima dimerico Timidilato Sintasi

ABSTRACT La timidilato sintasi umana (hTS) è un enzima omodimerico ubiquitario che riveste un ruolo fondamentale nei processi di replicazione e proliferazione cellulare, in quanto responsabile della sintesi de novo di un precursore essenziale per la biosintesi del DNA. In particolare, hTS catalizza la metilazione riduttiva del 2’-deossiuridina-5’-monofosfato (dUMP) a 2’-deossitimidina-5’-monofosfato (dTMP), utilizzando come cofattore l’acido N5,N10-metilentetraidrofolico (mTHF), il quale viene convertito in diidrofolato (DHF). Il dTMP prodotto viene successivamente fosforilato a 2’-deossitimidina-5’-trifosfato (dTTP), che viene infine incorporato nel DNA come nucleoside. Per questo motivo, hTS rappresenta da tempo un target terapeutico strategico in ambito oncologico. L’inibizione della hTS avviene principalmente tramite inibitori ortosterici, che si legano al sito attivo dell’enzima in competizione con il dUMP. Tra questi si includono il 5-fluorouracile (5-FU), attivo come 5-FdUMP, e antifolati come metotressato, raltitrexed (RTX) e pemetrexed (PMX). Tuttavia, il loro utilizzo a lungo termine è spesso ostacolato dalla comparsa di farmacoresistenza, che ne riduce l’efficacia terapeutica. Negli ultimi anni è stato dimostrato che hTS esiste in equilibrio tra una forma dimerica attiva e una monomerica inattiva (Kd= 74 nM). Questi studi hanno portato allo sviluppo di una strategia terapeutica volta a sfruttare tale equilibrio, inducendo la transizione verso la forma monomerica inattiva tramite l’impiego di dimer disrupters (DDis), capaci di legarsi all’interfaccia dimerica e destabilizzare l’enzima. Nel laboratorio di Drug Discovery and Biotechnology è stato avviato un progetto per identificare nuovi DDis, che ha portato alla sintesi di oltre 250 derivati con scaffold tiofenilacetamidico. Tra i composti sintetizzati, E7 e AIC-A16 si sono distinti per l’elevata attività inibitoria sull’enzima ricombinante, con valori di Ki pari rispettivamente a 1,76 µM e 1,09 µM. Tuttavia, sebbene AIC-A16 risulti efficace in vitro, ha mostrato una scarsa attività a livello cellulare. Entrambi i composti sono stati comunque selezionati come lead per lo sviluppo di nuovi derivati con migliori proprietà chimico-fisiche e farmacologiche. A partire da A16 è stata sviluppata la serie D, in cui il derivato D33 (Ki 1.81) si è distinto per una forte attività inibitoria sulle linee cellulari tumorali del colon-retto (HCT-116 e HT29) e su linee cellulari per tumore ovarico (A2780) (mettere % inibizione), ottenuta sostituendo un gruppo nitro (NO2) con un sostituente elettron-attrattore più forte come il trifluorometil (CF3). Tuttavia, tale modifica ha aumentato la lipofilia (logP = 5,35). Per migliorare le caratteristiche di solubilità di questi composti, è stata progettata una nuova serie di derivati con delle modifiche strutturali come l’introduzione di un anello piridinico al posto del benzene e gruppi polari come -OH,-CN sugli anelli aromatici per favorire anche una maggiore formazione di legami polari con la proteina. In sintesi, il presente lavoro di tesi ha riguardato i seguenti aspetti:  Progettazione di derivati di D33 con maggiore idrofilia (ridotto ClogP) mediante studi di molecular docking utilizzando la suite Maestro (Schrödinger);  Sintesi di 26 molecole (da AIC-D34 a AIC-D60) selezionate tra quelle progettate;  Test di inibizione on-target per la valutazione di IC50 e Ki dei composti sintetizzati  Valutazione dell’efficacia antiproliferativa su linee cellulari di carcinoma del colon-retto (CRC) e carcinoma ovarico.