L’infertilità è un fenomeno che interessa un numero crescente di coppie in età riproduttiva, con una prevalenza stimata intorno al 15%. In molti casi la causa rimane idiopatica e, quando non è possibile intervenire direttamente sui fattori che la determinano, l’approccio terapeutico si concentra sul miglioramento della risposta ovarica del partner femminile attraverso protocolli di stimolazione ormonale. Le tecniche di riproduzione assistita, in particolare la fecondazione in vitro, impiegano l’ormone follicolo-stimolante (FSH) per promuovere nelle pazienti la crescita e la maturazione multipla dei follicoli ovarici. Le preparazioni commerciali di FSH ricombinante contengono molecole con differente glicosilazione, dipendente dalle linee cellulari di origine, potenzialmente influenzandone la farmacodinamica e l’attivazione delle vie di trasduzione del segnale mediate dal recettore (FSHR). L’obiettivo di questo studio in vitro è confrontare due preparazioni commerciali di FSH: Gonal-f® (follitropina-α, Merck KGaA, Darmstadt, Germania), prodotta dalla linea cellulare di ovaio di criceto cinese “CHO”, e Rekovelle® (follitropina-δ, Ferring Pharmaceuticals, Saint-Prex, Svizzera) ottenuta dalla linea cellulare “PER.C6” derivata da cellule retiniche embrionali umane. Come modello sperimentale, sono state impiegate cellule HEK-293 trasfettate con plasmidi contenenti il cDNA di FSHR e/o specifici biosensori per biolumienscence resonance energy transfer (BRET). Le cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti di rFSH, e sono stati valutati gli effetti delle due molecole sulla formazione di omomeri di FSHR e sull’attivazione delle vie di trasduzione del segnale adenosina monofosfato ciclico (cAMP)/proteina chinasi A (PKA), responsabile dell’attività steroidogenica, e fosfolipasi C (PLC)/proteina chinasi C (PKC), coinvolta nei processi di proliferazione e sopravvivenza cellulare. In particolare, sono state misurate le interazioni FSHR-FSHR, i livelli intracellulari di cAMP e di ioni calcio (Ca²⁺) mediante metodica BRET, l’attivazione del promotore Nuclear factor of activated T cells (NFAT) utilizzando un gene reporter e la produzione di inositolo monofosfato (IP1) mediante homogeneous time resolved fluorescence (HTRF). I risultati ottenuti mostrano che entrambe le preparazioni attivano la via cAMP/PKA, inducendo l’accumulo intracellulare di cAMP. Nonostante non sia emersa differenza statisticamente significativa, poiché l’analisi dei valori di dose efficace al 50% (EC50) indica che Rekovelle® ha potenza simile a Gonal-f®, Gonal-f® 1 μM induce livelli di cAMP significativamente maggiori rispetto a Rekovelle®. Quest’ultima molecola induce una risposta bifasica, poiché la dose 1 μM media l’attivazione di livelli di cAMP intracllulare inferiori a quelli della dose 100 nM. Al contrario, nessuna delle due molecole in esame induce un incremento significativo del Ca²⁺ intracellulare, l’attivazione del promotore NFAT e l’accumulo intracellulare di IP1, evidenziando una mancata attivazione della via di trasduzione del segnale PLC/PKC. L’analisi della formazione di omomeri FSHR-FSHR, ha dimostrato che entrambe le molecole favoriscono l’interazione recettoriale in maniera dose-dipendente, ma non sono state riscontrate differenze statisticamente significative tra Gonal-f® e Rekovelle®. In conclusione, entrambe le preparazioni di FSH inducono l’attivazione della via cAMP/PKA in maniera differente, dal momento che la risposta a Rekovelle® è bifasica, mentre la via PLC/PKC non risulta significativamente attivata. Queste osservazioni suggeriscono l’esistenza di differenze tra le preparazioni, che possono contribuire al raggiungimento di trattamenti personalizzati per la fecondazione assistita.

Effetti in vitro di due preparazioni di FSH ricombinante su cAMP/PKA e PLC/PKC pathways

MERICO, GIORGIA
2024/2025

Abstract

L’infertilità è un fenomeno che interessa un numero crescente di coppie in età riproduttiva, con una prevalenza stimata intorno al 15%. In molti casi la causa rimane idiopatica e, quando non è possibile intervenire direttamente sui fattori che la determinano, l’approccio terapeutico si concentra sul miglioramento della risposta ovarica del partner femminile attraverso protocolli di stimolazione ormonale. Le tecniche di riproduzione assistita, in particolare la fecondazione in vitro, impiegano l’ormone follicolo-stimolante (FSH) per promuovere nelle pazienti la crescita e la maturazione multipla dei follicoli ovarici. Le preparazioni commerciali di FSH ricombinante contengono molecole con differente glicosilazione, dipendente dalle linee cellulari di origine, potenzialmente influenzandone la farmacodinamica e l’attivazione delle vie di trasduzione del segnale mediate dal recettore (FSHR). L’obiettivo di questo studio in vitro è confrontare due preparazioni commerciali di FSH: Gonal-f® (follitropina-α, Merck KGaA, Darmstadt, Germania), prodotta dalla linea cellulare di ovaio di criceto cinese “CHO”, e Rekovelle® (follitropina-δ, Ferring Pharmaceuticals, Saint-Prex, Svizzera) ottenuta dalla linea cellulare “PER.C6” derivata da cellule retiniche embrionali umane. Come modello sperimentale, sono state impiegate cellule HEK-293 trasfettate con plasmidi contenenti il cDNA di FSHR e/o specifici biosensori per biolumienscence resonance energy transfer (BRET). Le cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti di rFSH, e sono stati valutati gli effetti delle due molecole sulla formazione di omomeri di FSHR e sull’attivazione delle vie di trasduzione del segnale adenosina monofosfato ciclico (cAMP)/proteina chinasi A (PKA), responsabile dell’attività steroidogenica, e fosfolipasi C (PLC)/proteina chinasi C (PKC), coinvolta nei processi di proliferazione e sopravvivenza cellulare. In particolare, sono state misurate le interazioni FSHR-FSHR, i livelli intracellulari di cAMP e di ioni calcio (Ca²⁺) mediante metodica BRET, l’attivazione del promotore Nuclear factor of activated T cells (NFAT) utilizzando un gene reporter e la produzione di inositolo monofosfato (IP1) mediante homogeneous time resolved fluorescence (HTRF). I risultati ottenuti mostrano che entrambe le preparazioni attivano la via cAMP/PKA, inducendo l’accumulo intracellulare di cAMP. Nonostante non sia emersa differenza statisticamente significativa, poiché l’analisi dei valori di dose efficace al 50% (EC50) indica che Rekovelle® ha potenza simile a Gonal-f®, Gonal-f® 1 μM induce livelli di cAMP significativamente maggiori rispetto a Rekovelle®. Quest’ultima molecola induce una risposta bifasica, poiché la dose 1 μM media l’attivazione di livelli di cAMP intracllulare inferiori a quelli della dose 100 nM. Al contrario, nessuna delle due molecole in esame induce un incremento significativo del Ca²⁺ intracellulare, l’attivazione del promotore NFAT e l’accumulo intracellulare di IP1, evidenziando una mancata attivazione della via di trasduzione del segnale PLC/PKC. L’analisi della formazione di omomeri FSHR-FSHR, ha dimostrato che entrambe le molecole favoriscono l’interazione recettoriale in maniera dose-dipendente, ma non sono state riscontrate differenze statisticamente significative tra Gonal-f® e Rekovelle®. In conclusione, entrambe le preparazioni di FSH inducono l’attivazione della via cAMP/PKA in maniera differente, dal momento che la risposta a Rekovelle® è bifasica, mentre la via PLC/PKC non risulta significativamente attivata. Queste osservazioni suggeriscono l’esistenza di differenze tra le preparazioni, che possono contribuire al raggiungimento di trattamenti personalizzati per la fecondazione assistita.
2024
Glicosilazione
FSH
FSHR
cAMP
Ioni calcio
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