SVILUPPO DI NUOVI CARRIERS A BASE DI NANOFIBRE DI ALCOL POLIVINILICO E GELATINA PER LA RIGENERAZIONE DELL’ENDOTELIO CORNEALE

The corneal endothelium consists of a monolayer of endothelial cells (CECs) that are essential for maintaining corneal transparency and visual function. Located in contact with Descemet's membrane, these cells regulate fluid exchange and preserve stromal deturgescence through specific ionic pumps. In adults, they exhibit limited proliferative capacity, with their density progressively decreasing with age or following pathological and traumatic events. When the concentration drops below 400–500 cells/mm², corneal edema and opacity develop. The main causes of deterioration include Fuchs' dystrophy, trauma, infections, surgical complications, and the natural aging process. Currently, corneal transplantation represents the only established treatment; however, it presents significant limitations related to donor scarcity, rejection risk, potential post-operative complications, and high costs. To overcome these obstacles, there is growing interest in innovative tissue engineering approaches based on biomimetic scaffolds capable of supporting CEC adhesion and proliferation, effectively replacing Descemet's membrane or providing optimal substrates for in vitro cell cultures. Poly(vinyl alcohol) (PVA) emerges as a particularly promising material for these applications due to its biocompatibility, hydrophilicity, cost-effectiveness, and ease of preparation. Once hydrated, PVA behaves as a hydrogel, making it ideal for both scaffolds intended for regenerative medicine and drug delivery applications. The electrospinning technique employed in this research allows the production of porous matrices composed of nanofibers with morphology similar to the natural extracellular matrix. Despite its widespread use in the biomedical field, examples of application in corneal endothelial regeneration remain limited. The objective of this work was to develop new carriers based on PVA nanofiber matrices. During the research, I focused on optimizing both the properties of the polymeric solution (optimal viscosity, concentration, and molecular weight) and the deposition parameters (applied voltage, flow rate, needle-to-collector distance, collector rotation speed) to obtain porous scaffolds with nanofibers of uniform distribution and diameter. I also evaluated the optimal post-deposition crosslinking process (thermal or chemical with different crosslinking agents) to render the obtained nanofiber matrix insoluble. Based on initial cell tests and to improve the material's bioactivity, I developed a new experimental protocol to produce composite nanofiber matrices of PVA and gelatin with different gelatin percentages. Preliminary biocompatibility evaluation was conducted by analyzing CEC adhesion using a fibronectin, albumin, and collagen (FNC) coating to promote initial cell adhesion. Preliminary results obtained with electrospun samples of pure PVA and PVA/gelatin composites showed that only samples containing 20% w/w gelatin effectively support CEC adhesion, as confirmed by immunofluorescence analysis and scanning electron microscopy (SEM). These data, although preliminary, suggest that electrospun matrices based on PVA and gelatin possess promising properties for application in corneal endothelial regeneration. However, further in vitro studies will be necessary for a complete evaluation of this new carrier's efficacy.

L'endotelio corneale è costituito da un monostrato di cellule endoteliali (CEC) fondamentali per mantenere la trasparenza e la funzione visiva della cornea. Localizzate a contatto con la membrana di Descemet, queste cellule regolano gli scambi di fluidi e preservano la deturgescenza stromale attraverso specifiche pompe ioniche. Negli adulti presentano una capacità proliferativa limitata: la loro densità diminuisce progressivamente con l'età o in seguito a eventi patologici e traumatici. Quando la concentrazione scende al di sotto di 400–500 cellule/mm², si sviluppano edema e opacità corneale. Le principali cause di deterioramento includono la distrofia di Fuchs, traumi, infezioni, complicanze chirurgiche e il naturale processo di senescenza. Attualmente, il trapianto corneale rappresenta l'unico trattamento consolidato, tuttavia presenta significativi limiti legati alla scarsità di donatori, al rischio di rigetto, alle possibili complicazioni post-operatorie e agli elevati costi. Per superare questi ostacoli, cresce l'interesse verso approcci innovativi di ingegneria tissutale basati su scaffold biomimetici in grado di supportare l'adesione e la proliferazione delle CEC, sostituendo efficacemente la membrana di Descemet o fornendo substrati ottimali per le colture cellulari in vitro. Il poli(vinil alcol) (PVA) emerge come materiale particolarmente promettente per queste applicazioni grazie alle sue caratteristiche di biocompatibilità, idrofilicità, economicità e facilità di preparazione. Una volta idratato, il PVA si comporta come un idrogelo, risultando ideale sia per scaffold destinati alla medicina rigenerativa che per applicazioni di drug delivery. La tecnica dell'elettrospinning, impiegata in questa ricerca, consente di ottenere matrici porose costituite da nanofibre con morfologia simile alla matrice extracellulare naturale. Nonostante la sua ampia diffusione nel settore biomedico, gli esempi di applicazione nella rigenerazione dell'endotelio corneale rimangono ancora limitati. L'obiettivo di questo lavoro è stato sviluppare nuovi carriers basati su matrici di nanofibre di PVA. Durante la ricerca, mi sono concentrato sull'ottimizzazione sia delle proprietà della soluzione polimerica (viscosità, concentrazione e peso molecolare ottimali) che dei parametri di deposizione (tensione applicata, velocità di flusso, distanza ago-collettore, velocità di rotazione del collettore) per ottenere scaffold porosi con nanofibre dalla distribuzione e dal diametro uniformi. Ho inoltre valutato il processo ottimale di crosslinking post-deposizione (termico o chimico con diversi agenti reticolanti) per rendere insolubile la matrice nanofibrosa ottenuta. Sulla base dei primi test cellulari e per migliorare la bioattività del materiale, ho sviluppato un nuovo protocollo sperimentale per produrre matrici nanofibrose composite di PVA e gelatina con diverse percentuali di gelatina. La valutazione preliminare della biocompatibilità è stata condotta analizzando l'adesione delle CEC utilizzando un coating di fibronectina, albumina e collagene (FNC) per favorire l'adesione cellulare iniziale. I risultati preliminari ottenuti con campioni elettrofilati di PVA puro e compositi PVA/gelatina hanno evidenziato che solo i campioni contenenti gelatina al 20% w/w supportano efficacemente l'adesione delle CEC, come confermato dalle analisi in immunofluorescenza e al microscopio a scansione elettronica (SEM). Questi dati, sebbene preliminari, suggeriscono che le matrici elettrofilate a base di PVA e gelatina possiedano proprietà promettenti per l'applicazione nella rigenerazione dell'endotelio corneale. Tuttavia, saranno necessari ulteriori studi in vitro per una valutazione completa dell'efficacia di questo nuovo carrier.