A Comprehensive Genome Survey of genes related to health-promoting traits in Levilactobacillus brevis LYBH3: a novel probiotic candidate with bile salt hydrolases-positive phenotype

I lattobacilli di origine alimentare sono ampiamente riconosciuti per il loro potenziale probiotico, in particolare grazie alla capacità di tollerare e deconiugare i sali biliari, essenziale per la sopravvivenza nel tratto gastrointestinale. Le idrolasi dei Sali biliari (BSH) catalizzano la deconiugazione dei sali biliari ,una funzione chiave nella selezione dei ceppi probiotici. Tra queste specie, Levilactobacillus brevis è noto per la sua tolleranza ai sali biliari, la persistenza intestinale e gli effetti ipocolesterolemizzanti, principalmente legati all’attività BSH. In un nostro precedente studio, L. brevis LYB03, isolato da pasta madre, è stato valutato per la sua tolleranza ai sali biliari e la capacità di deconiugazione. Il ceppo è stato in grado di crescere in presenza di singoli acidi biliari come GCA (acido glico-colico), GDCA (acido glico-deossicolico), GCDCA (acido glico-chenodeossicolico), TCA (acido taurocolico), TDCA (acido tauro-deossicolico) e TCDCA (acido tauro-chenodeossicolico) a concentrazioni fino all’1% p/v. Le analisi UHPLC/HR-MS dei surnatanti in fase stazionaria hanno confermato una forte capacità deconiugante del ceppo LYB03, con una marcata preferenza per i sali biliari coniugati alla glicina rispetto a quelli coniugati alla taurina. Il presente studio mira a chiarire le basi genetiche di questo fenotipo, a caratterizzare ulteriori tratti probiotici di LYB03 e a valutare l’espressione dei geni bsh in presenza di una miscela di sali biliari piuttosto che di singoli acidi. Il genoma di LYB03 è stato completamente sequenziato e assemblato, risultando in 72 contig per una dimensione totale di 2,40 Mbp (2.375 CDS). L’analisi di biosicurezza ha confermato l’assenza di geni di resistenza agli antibiotici e di virulenza. La presenza di un replicone plasmidico (rep28[pCIS4]) ha suggerito un singolo plasmide, mentre array CRISPR distali indicano un sistema CRISPR-Cas potenzialmente inattivo. Sono stati identificati due cluster putativi di batteriocine e un operone gad completo per la biosintesi dell’acido γ-aminobutirrico (GABA), a supporto di un potenziale antimicrobico e neuroattivo. L’analisi dei polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) di LYB03 con altri 174 genomi di L. brevis ha rivelato tre distinti cluster di popolazione, parzialmente correlati all’origine dell’isolamento, in linea con studi precedenti che riportano un’elevata diversità naturale della specie. L’analisi comparativa con 9 ceppi rappresentativi di tali cluster ha identificato il 36,3% di geni core e il 32,9% di geni specifici di LYB03. Nel genoma di LYB03 sono stati individuati tre geni bsh distinti (bsh_1A, bsh_2A e bsh_3A). Un’analisi filogenetica condotta su un dataset comprendente 76 sequenze proteiche BSH di L. brevis, quattro BSH di Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 e nove penicillin V acylase (PVA), strutturalmente correlate alle BSH, ha mostrato che le BSH di L. brevis si raggruppano in tre cluster (I, II e III), con la maggior parte dei ceppi che possiede almeno due geni bsh. In LYB03, bsh_2A e bsh_3A si sono raggruppati rispettivamente nei cluster II e III, mentre bsh_1A è risultato filogeneticamente distinto, mostrando elevata similarità alle PVA ed è stato riclassificato come pva. I saggi di crescita in MRS contenente l’1% di sali biliari hanno evidenziato una fase lag prolungata e una ridotta resa in biomassa, indicando un adattamento rallentato allo stress biliare. Le analisi RT-qPCR hanno rivelato una significativa sovraespressione di bsh_2A e bsh_3A in fase stazionaria, suggerendo una risposta adattativa a lungo termine all’esposizione ai sali biliari. Le caratteristiche genomiche e funzionali di L. brevis LYB03 ne evidenziano il potenziale come ceppo probiotico sicuro e BSH-positivo, capace di modulare il metabolismo degli acidi biliari e contribuire alla salute dell’ospite.

Lactobacilli from food sources are widely recognized for their probiotic potential, particularly due to their ability to tolerate and deconjugate bile salts, an essential feature for survival in the gastrointestinal tract. Bile Salt Hydrolase (BSH) enzymes catalyze bile salt deconjugation, thereby representing a key functional feature in probiotic candidates. Among these species, Levilactobacillus brevis is notable for its bile tolerance, intestinal persistence, and cholesterol-lowering effects, primarily linked to BSH activity. In our previous study, L. brevis LYB03, isolated from sourdough, has been evaluated for its bile salt tolerance and deconjugation capacity. The strain was able to grown in presence of individual bile acids such as GCA (glycocholic acid), GDCA (glycodeoxycholic acid), GCDCA (glycochenodeoxycholic acid), TCA (taurocholic acid), TDCA (taurodeoxycholic acid), and TCDCA (taurochenodeoxycholic acid) at the concentrations up to 1% w/v. UHPLC/HR-MS analysis of stationary growth phase supernatants confirmed a strong deconjugating ability of LYBH3 with a marked preference for glycol-conjugated over tauro-conjugated bile acids. The present study aims to elucidate the genetic basis of this bile acids deconjugating phenotype, characterize additional probiotic traits in LYBH3, and assess bsh gene expression under exposure to bile salt mixture rather than individual bile acids. The genome of LYB03 was fully sequenced and assembled, resulting in 72 contig representing a genome size of 2.40 Mbp (2,375 CDS). Biosafety assessment confirmed the absence of antibiotic resistance and virulence genes. The presence of a plasmid replicon (rep28[pCIS4]) suggested a single plasmid, while distally located CRISPR arrays indicated a potentially inactive CRISPR-Cas system. Two putative bacteriocin clusters and a complete gad operon for γ-aminobutyric acid (GABA) biosynthesis were identified, supporting antimicrobial and neuroactive potential. Core SNPs analysis of L. brevis LYBH3 and other 174 L. brevis genomes revealed three distinct population clusters, partially linked to isolation source. This result aligns with previous studies reporting a high natural diversity within the species. Comparative genome analysis involving LYBH3 and 9 representative strains of the previous validated clusters identified 36.3% core genes and 32.9% strain-specific genes in LYBH3 genome. Three distinct bsh genes were identified in LYB03 genome (bsh_1A, bsh_2A, and bsh_3A). A phylogenetic analysis was conducted on a dataset which included 76 BSH protein sequences from L. brevis, alongside four BSH proteins from Lactiplantibacillus plantarum strain WCFS1, and 9 penicillin V acylase (PVA) proteins which are structurally related to BSH proteins. This survey revealed that L. brevis BSH proteins were divided into three clusters, namely cluster I, cluster II, and cluster III, with most strains harboring at least two bsh genes. Among the three putative bsh genes identified in LYB03, bsh_2A and bsh_3A grouped with clusters II and III, respectively, whereas bsh1 was phylogenetically distinct, showing high similarity to PVA and was renamed as pva. Growth assays in MRS medium supplemented with 1% bile salts showed prolonged lag phase and reduced biomass yield, indicating a delayed adaptation to bile stress. RT-qPCR analysis revealed significant upregulation of bsh_2A and bsh_3A during the stationary phase, suggesting a long-term adaptive response to bile exposure. In conclusion, L. brevis LYB03 demonstrates robust bile salt tolerance and harbors multiple probiotic-associated traits without safety concerns. Its genomic and functional features highlights its potential as a safe, BSH-positive probiotic candidates capable of modulating bile acid metabolism and contributing to host health.