Caratterizzazione delle linee iPSC-MN GFP-HSPB3 WT, GFP-HSPB3 Y118H, GFP-HSPB3 R116P

HSPB3 è una piccola proteina da shock termico (sHSP/HSPB) le cui funzioni fisiologiche sono ad oggi incerte, fatta eccezione per un potenziale ruolo durante il differenziamento muscolare, con meccanismi ancora poco studiati. Mutazioni a carico del gene codificante per HSPB3 sono associate a patologie caratterizzate dalla degenerazione dei nervi periferici, note come neuropatie periferiche ereditarie (HPN). In particolare, le mutazioni R116P e Y118H sono associate rispettivamente a miopatia congenita e malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2 (Morelli et al., 2017; Nam et al., 2018). Ciò fa ipotizzare il coinvolgimento di HSPB3 nel mantenimento del sistema neuromuscolare. Da un lato, HSPB3 è indotta durante il differenziamento del muscolo scheletrico dove svolge un’attività pro-differenziativa, in quanto promuove l’espressione di geni richiesti durante la miogenesi (Tiago et al., 2021). Dall’altro, da studi recenti condotti su D. melanogaster, è emerso che l’espressione della mutazione Y118H comporta una riduzione significativa delle capacità motorie in vivo (Han et al., 2023). HSPB3 è espressa sia nel muscolo scheletrico che nei motoneuroni (La Padula et al., 2016; Sugiyama et al., 2000), quindi la ricerca sulle funzioni e sull’attività di HSPB3 in queste due tipologie cellulari potrebbe aiutare a migliorare la comprensione dei meccanismi fisiologici e patogenetici che sottendono diverse patologie neuromuscolari, al fine di individuare nuovi target terapeutici per contrastare il peggioramento dei sintomi e l’insorgenza di una sintomatologia grave. Lo scopo del mio elaborato di tesi è comprendere se le varianti R116P e Y118H di HSPB3, associate a HPN, possono influenzare il differenziamento dei motoneuroni. Per fare ciò, sono stati generati in vitro dei motoneuroni spinali a partire da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-MN). Nello specifico, sono state generate tre linee: GFP-HSPB3 WT, GFP-HSPB3 R116P e GFP-HSPB3 Y118H. Per valutare il corretto differenziamento delle iPSC a motoneuroni spinali è stato eseguito un confronto tra le linee di mutanti e la linea wild-type, attraverso RT-qPCR per la valutazione dell’espressione genica di specifici fattori associati a staminalità o a differenziamento neuronale e attraverso Western Blot per lo studio dell’induzione proteica. Infine, è stata eseguita una Sholl Analisi che, attraverso la caratterizzazione dell’arborizzazione dendritica, ha permesso di comprendere meglio l’impatto delle varianti di HSPB3 sul differenziamento a motoneuroni spinali.