Internalizzazione e signalling FSH-dipendente di recettori eteromerici ovarici

L’ormone follicolo-stimolante (FSH) regola la riproduzione supportando lo sviluppo dei follicoli ovarici e la produzione di ormoni sessuali steroidei. Il legame di FSH al suo recettore (FSHR) induce, nelle cellule ovariche della granulosa, l’attivazione di cascate di trasduzione del segnale e il trafficking intracellulare mediato da β-arrestina. Recenti studi hanno dimostrato che FSHR interagisce con il recettore degli estrogeni accoppiato a proteina G (GPER) formando complessi eteromerici. Questi inibiscono l’attivazione FSH-dipendente della pathway dell’adenosina monofosfato ciclico/proteina chinasi A (cAMP/PKA), riducendo l’attività steroidogenica e pro-apoptotica dell’FSH e favorendo segnali proliferativi necessari per la sopravvivenza dei follicoli. Lo scopo dello studio è valutare il ruolo di GPER nel modulare il trafficking di FSHR e il signalling FSH-dipendente mediato dal comparto endosomiale. La linea cellulare human embryonic kidney 293 (HEK293) è stata trasfettata transientemente con plasmidi codificanti FSHR e GPER ed è stata trattata con FSH, in presenza o in assenza dell’inibitore della dinamina “Dynasore”. Le interazioni tra FSHR, coniugato con Renilla luciferasi (Rluc), e la sequenza CAAX fusa con una yellow fluorescent protein (yfp), o con la proteina FYVE-ypf, marcatori rispettivamente della localizzazione in membrana o intracellulare del recettore, è stata valutata tramite bioluminescence resonance energy transfer (BRET), in presenza o assenza di GPER. La stessa metodica è stata utilizzata per analizzare, in cellule over-esprimenti i due recettori, le interazioni tra FSHR-/GPER-Rluc e β-arrestina-yfp, l’accumulo intracellulare di cAMP e la fosforilazione di extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2), mediante specifici biosensori. La vitalità cellulare è stata misurata mediante saggio del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). I risultati ottenuti dimostrano che, in cellule co-esprimenti i recettori FSHR e GPER, le interazioni di FSHR con il motivo di membrana CAAX, e con la proteina citoplasmatica FYVE sono rispettivamente aumentate e ridotte, rispetto alle cellule esprimenti solo FSHR, suggerendo che GPER favorisce il mantenimento del complesso recettoriale in membrana. Come precedentemente dimostrato, è stato osservato che la co-espressione di FSHR e GPER modula l’attivazione FSH-dipendente della via di trasduzione del segnale cAMP/PKA, inibendo la produzione di cAMP intracellulare e aumentando la vitalità cellulare. Il meccanismo di inibizione è tuttavia indipendente dall’internalizzazione del dimero, in quanto il trattamento cellulare con l’inibitore Dynasore non porta ad alcuna variazione del risultato. È stato inoltre dimostrato l’effetto inibitorio di GPER sia sull’interazione di FSHR con la proteina β-arrestina, in assenza e in presenza di Dynasore, sia sulla fosforilazione di ERK1/2, la cui attivazione dipende sia da cAMP che dalla β-arrestina. Al contrario, è emerso che GPER interagisce con la β-arrestina, anche in presenza di FSHR. Ciò suggerisce che GPER supporti il trafficking degli eteromeri attraverso il reclutamento della β-arrestina. In conclusione, questo studio dimostra il coinvolgimento di GPER nella modulazione di signalling e trafficking mediato da FSHR. In particolare, la co-espressione dei due recettori in cellule HEK293 aumenta la localizzazione in membrana dei dimeri, inibisce la produzione di cAMP intracellulare, la fosforilazione di ERK1/2, e il reclutamento di β-arrestina. L’internalizzazione del complesso FSHR-GPER avviene attraverso il reclutamento della β-arrestina da parte di GPER. I dati ottenuti consolidano l’ipotesi dell’esistenza di partner di membrana di FSHR, con potenziali implicazioni sulla regolazione della fisiologia ovarica.