L’inibizione di GSK3β Preserva il Fenotipo di Cellule Corneali Endoteliali Umane (HCEnCs): Analisi Molecolari

The cornea is the transparent interface between the eye and the external environment; visual quality largely depends on the corneal endothelium, the inner monolayer that regulates stromal hydration. In adulthood, endothelial cell density (ECD) declines physiologically (~0.6%/year) and, because human corneal endothelial cells (HCEnCs) do not proliferate in vivo, maintenance of the cell sheet relies on enlargement and migration of residual cells. When ECD falls below ~500 cells/mm², endothelial pump function becomes insufficient, leading to stromal edema, corneal opacity, and visual impairment. Although transplantation is effective, the chronic shortage of donor tissue (≈1 cornea available for every 70 needed) prioritizes alternative approaches, particularly in vitro expansion and tissue engineering. In this context, pharmacological modulation of signaling pathways—most notably inhibition of GSK3β with CHIR99021 (CHIR)—has emerged as a strategy to support endothelial homeostasis and identity. This thesis investigates, through an integrated approach, the impact of GSK3β inhibition on cellular identity, monolayer organization, and molecular programs of primary HCEnCs. Cultures derived from human donors were compared under three experimental conditions: untreated control (CTRL); continuous CHIR treatment initiated on day 1 and maintained to the end of culture (CHIR); and CHIR initiated on day 1 and withdrawn on day 10, followed by culture in low-stimulation, growth factor–free medium (CHIR OUT). The analysis combines monolayer morphology assessments (circularity and area), protein expression of junctional and mesenchymal markers, and transcriptomic profiling (bulk RNA-seq) with differential expression and functional enrichment analyses. The aim is to determine whether GSK3β inhibition promotes a “low-activation” state compatible with endothelial identity, reduces pro-mesenchymal traits, and preserves part of the benefit after inhibitor withdrawal, thereby informing operational choices for translational expansion protocols. Preliminary data suggest that CHIR favors a more ordered and cohesive monolayer with evidence of junctional preservation and attenuation of mesenchymal programs; the transcriptomic profile is consistent with reduced pro-proliferative/inflammatory axes and modulation of pathways related to structural stability. Effects observed in CHIR OUT appear intermediate, indicating partial persistence of benefit. Further functional validations are underway to consolidate the applicability of this approach in corneal endothelial engineering.

La cornea è l’interfaccia trasparente tra occhio e ambiente; la qualità visiva dipende in larga parte dall’endotelio, monostrato interno che regola l’idratazione dello stroma. In età adulta la densità cellulare endoteliale (ECD) diminuisce fisiologicamente (~0,6%/anno) e, poiché le cellule endoteliali corneali umane (HCEnC) non proliferano in vivo, il mantenimento del tappeto cellulare si basa su ingrandimento e migrazione delle cellule residue. Quando l’ECD scende sotto ~500 cellule/mm², la funzione di pompa non è più sufficiente e compaiono edema, opacità e deficit visivo. Sebbene il trapianto sia efficace, la cronica scarsità di tessuti (≈1 disponibile ogni 70 necessari) rende prioritari approcci alternativi, in particolare l’espansione in vitro e l’ingegneria tissutale. In questo quadro, la modulazione farmacologica delle vie di segnalazione, in particolare l’inibizione di GSK3β tramite CHIR99021 (CHIR), è emersa come strategia per sostenere l’omeostasi e l’identità endoteliale. Questa tesi indaga in modo integrato l’effetto dell’inibizione di GSK3β sull’identità cellulare, sull’organizzazione del monostrato e sui programmi molecolari di HCEnC primarie. Colture da donatori umani sono state confrontate in tre condizioni sperimentali: controllo non trattato (CTRL); trattamento continuo con CHIR avviato al giorno 1 e mantenuto fino al termine della coltura (CHIR); trattamento con CHIR avviato al giorno 1 e rimosso al giorno 10, con prosecuzione in terreno a bassa stimolazione privo di fattori di crescita (CHIR OUT). L’analisi combina valutazioni morfologiche del monostrato (circolarità e area), analisi dell’espressione proteica per marcatori giunzionali e mesenchimali e profilazione trascrittomica (bulk RNA-seq) con espressione differenziale e arricchimento funzionale. L’obiettivo è verificare se l’inibizione di GSK3β promuova uno stato “a bassa attivazione” compatibile con l’identità endoteliale, riduca tratti pro-mesenchimali e mantenga parte del beneficio dopo la rimozione dell’inibitore, fornendo indicazioni operative per protocolli di espansione in ottica traslazionale. In via preliminare, i dati suggeriscono che CHIR favorisca un monostrato più ordinato e coeso, con segnali di preservazione delle giunzioni e attenuazione di programmi mesenchimali; il profilo trascrizionale appare coerente con la riduzione di assi pro-proliferativi/infiammatori e con la modulazione di vie associate alla stabilità strutturale. Gli effetti osservati nella condizione CHIR OUT risultano intermedi, indicando una parziale persistenza del beneficio. Ulteriori validazioni funzionali sono in corso per consolidare l’applicabilità dell’approccio nei percorsi di ingegneria dell’endotelio corneale.