Conservazione, caratterizzazione e applicazioni biotecnologiche di microbiomi da bevande fermentate

Microbial culture collections represent a fundamental resource for the management, conservation, and valorization of microbial biodiversity. While protocols for the preservation of pure microbial strains are now well established, the conservation of microbiomes - the complex microbial communities and their associated genomic elements that inhabit a well-defined environment and display specific metabolic activities - still represents an open challenge in terms of methodologies and operational standards. At present, the use of starter cultures in the food industry for the production of fermented products is a widespread practice. However, an in-depth study of the microbiomes associated with fermented foods could provide valuable insights for the development of novel biotechnological processes. In this context, the main objective of this thesis was to evaluate the feasibility of long-term preservation of microbiomes isolated from fermented beverages. In addition, the identification of cultivable microorganisms isolated from the different microbiomes was carried out with the aim of assembling microbial communities exhibiting fermentative capacities similar to those of the native microbiomes. The selected microbiomes, sampled from Kombucha tea and vinegar, were preserved by lyophilization and cryopreservation at –80 °C for 4, 7, and 12 months. Using both culture-dependent and culture-independent approaches, a comparative analysis of pre- and post-preservation microbiomes was performed to assess the impact of different preservation methods on the viability and fermentative functionality of the microbial communities. All microbial isolates were subjected to phenotypic and molecular characterization through molecular fingerprinting (GTG5-PCR) and sequencing of 16S rDNA and ITS genes for bacteria and yeasts, respectively. Overall, the obtained results indicated that both preservation strategies - lyophilization and cryopreservation - successfully maintained good microbial viability over time. Cryopreservation was showed to be more effective in preserving the fermentative functionality of the microbiomes. Therefore, this study provided concrete evidence supporting the feasibility of long-term microbiome preservation not only for safeguarding microbial biodiversity but also for enabling a more in-depth characterization. The preliminary comparative analysis of the metabolic activity of the assembled microbial communities and the fermentative activity of the native microbiomes proved to be essential for identifying the microbial consortium to be used for subsequent investigations on microbial interaction dynamics and for enhancing its potential in biotechnological applications. Part of this work was funded by the European Commission – NextGenerationEU, Project SUS-MIRRI.IT “Strengthening the MIRRI Italian Research Infrastructure for Sustainable Biosciences and Bioeconomy,” code N° IR0000005.

Le collezioni di colture microbiche costituiscono una risorsa fondamentale per la gestione, la conservazione e la valorizzazione della biodiversità microbica. Sebbene i protocolli per la conservazione di ceppi microbici puri siano ormai ben consolidati, la conservazione dei microbiomi, cioè le comunità microbiche complesse e i relativi elementi genomici che occupano un ben definito ambiente presentando specifiche attività metaboliche, rappresenta ancora una sfida aperta in termini di metodologie e standard operativi. Attualmente l’impiego di colture starter nell’industria alimentare per l’ottenimento di prodotti fermentati è una pratica molto comune. Tuttavia, uno studio approfondito dei microbiomi di alimenti fermentati potrebbe fornire importanti conoscenze per nuovi processi biotecnologici. In questo contesto, l’obiettivo principale del presente lavoro di tesi ha riguardato la valutazione della possibilità di conservazione a lungo termine di microbiomi isolati da bevande fermentate. Inoltre, è stato anche condotto uno studio di identificazione dei microrganismi coltivabili isolati dai microbiomi con lo scopo di assemblare delle comunità microbiche con capacità fermentative simili a quelle dei microbiomi di partenza. I microbiomi scelti, campionati da tè Kombucha e aceto, sono stati conservati mediante liofilizzazione e crioconservazione a -80 °C per 4, 7 e 12 mesi. Attraverso approcci sia coltura-dipendenti che coltura-indipendenti, è stata eseguita un’analisi comparativa dei microbiomi pre- e post-conservazione per valutare l’impatto delle diverse metodologie di conservazione sulla vitalità e sulla funzionalità fermentativa delle comunità microbiche. Tutti gli isolati microbici sono stati sottoposti a caratterizzazione fenotipica e molecolare mediante fingerprinting molecolare (GTG5-PCR) e sequenziamento dei geni 16S rDNA e ITS, rispettivamente per batteri e lieviti. Nel complesso, i risultati ottenuti hanno indicato che entrambe le strategie di conservazione, liofilizzazione e crioconservazione, hanno preservato nel tempo una buona vitalità dei gruppi microbici. La crioconservazione ha presentato maggiore efficacia nel mantenimento della funzionalità fermentativa dei microbiomi. Pertanto, lo studio condotto ha fornito evidenze concrete sulla possibilità di preservare a lungo termine i microbiomi non solo per salvaguardarne la biodiversità, ma anche per approfondirne la caratterizzazione. Inoltre, l’analisi preliminare di comparazione della capacità fermentativa delle comunità microbiche assemblate e dell’attività fermentativa dei microbiomi nativi si è rivelata fondamentale per identificare il consorzio microbico più idoneo su cui effettuare successivi approfondimenti sulle dinamiche di interazione microbica al fine di sfruttarne le potenzialità in ambito biotecnologico. Parte di questo lavoro di tesi è stato finanziato dalla Commissione Europea - NextGenerationEU, Progetto SUS-MIRRI.IT "Rafforzamento dell'infrastruttura di ricerca italiana MIRRI per bioscienze e bioeconomia sostenibili", codice n. IR0000005.