Cationic lipid nanoparticles for RNA delivery: production, characterization, in vitro evaluation

Uno dei limiti della medicina e dei farmaci convenzionali è la cura delle malattie genetiche, in quanto queste richiedono un trattamento più mirato, inoltre gli approcci terapuetici comuni offrono solo miglioramenti sintomatici e a breve termine. Tra queste patologie, la retinite pigmentosa è caratterizzata dalla degenerazione dei fotorecettori e del tessuto epiteliale pigmentato che porta a una forte riduzione della vista, fino alla cecità. Negli ultimi anni, l’avanzare della nanomedicina ha permesso l’impiego di acidi nucleici (es. siRNA, mRNA) come principi attivi per il trattamento di malattie genetiche e non genetiche. Per avere una veicolazione corretta, vengono impiegati frequentemente vettori non virali quali nanoparticelle lipidiche, in quanto questi sistemi possono prevenire la degradazione del materiale genetico e permettono di massimizzare la loro efficacia in vivo. In questo studio, è stata ottimizzata una formulazione di nanoparticelle lipidiche cationiche precedentemente realizzata, per la veicolazione di materiale genetico per il trattamento della retinite pigmentosa. In particolare, sono stati testati modelli di mRNA e siRNA come molecole cargo. L’attenzione è stata posta sulla massimizzazione della quantità di materiale genetico veicolato dalle nanoparticelle e sulla diminuzione della concentrazione di fase organica, per ottenere una formulazione stabile e allo stesso tempo non tossica. Inoltre la formulazione delle nanoparticelle lipidiche è stata fatta utilizzando la tecnica della microfluidica, adattando così una formulazione di scala laboratoriale a un sistema automatizzato che rispetta le norme GMP. La caratterizzazione delle nanoparticelle lipidiche è stata fatta valutando dimensione, indice di polidispersione (PdI), potenziale zeta, efficienza di incapsulazione, stabilità durante la conservazione dopo cicli di congelamento-scongelamento a diverse temperature e liofilizzazione. Sono stati eseguiti saggi di uptake cellulare e citotossicità sui modelli più performanti. Infine, la composizione migliore è stata formulata per incapsulare mRNA-GFP, al fine di valutarne l’efficienza di veicolazione in modelli in vitro. In generale, questo studio dimostra che l’impiego di nanoparticelle lipidiche per la la cura di malattie genetiche, come la retinite pigmentosa, è molto promettente per l’alta efficacia terapeutica, la capacità di ridurre la dose somministrata e la minimizzazione degli effetti collaterali. Inoltre, evidenzia la versatilità della tecnica della microfluidica per la produzione su scala industriale di queste nanomedicine.

One of the most common limitations of medicine and conventional drugs is the cure of genetic diseases given the fact that these illnesses require a more targeted treatment, and that common therapeutic strategies only offer short-term symptomatic ameliorations. Among these diseases, retinitis pigmentosa (RP) is characterized by the degeneration of photoreceptors and the retinal pigment epithelium tissue which leads to severe vision decrease, ultimately leading to blindness. In recent years, advances in nanomedicine paved the way for the employment of nucleic acids (i.e. siRNA, mRNA) as Active Pharmaceutical Ingredients (APIs) to treat both genetic and non-genetic diseases. To achieve a correct delivery, non-viral vectors such as lipid nanoparticles (LNPs) are frequently employed, as these delivery systems can prevent their degradation and maximize their in vivo efficacy. In this study, a previously designed formulation of cationic LNPs has been further optimized for the delivery of genetic material to treat RP: testing non-coding mRNA and siRNA as model cargos. The focus was to maximize the amount of genetic material that the LNPs could deliver and decrease the concentration of the organic phase to maintain both a stable and less toxic formulation. Moreover, these LNPs were formulated using the microfluidic technique, transitioning the formulation from bench-top to an automated, GMP-grade protocol. The LNPs were characterized by evaluating their size, PdI, Zeta Potential, encapsulation efficiency, and storage stability after freeze-thaw cycles at different temperatures, and lyophilization. Cellular uptake and cytotoxicity assays were performed on the most promising candidates. Lastly, the best composition was formulated to encapsulate GFP-coding reporter mRNA to assess transfection efficacy in human retinal pigment epithelial (hRPE) cells. Overall, this study demonstrates that the use of nanomedicines against genetic diseases, such as RP, is very promising due to its high therapeutic efficiency, the ability to reduce the dose administered and minimize side effects. Moreover, it highlights the versatility of the microfluidic technique for the industrial-scale production of these types of nanomedicines.