EXPLORATION OF FOURIER TRANSFORM INFRARED MICROSPECTROSCOPY FOR KINETIC MONITORING OF THE GLYCOLYSIS PATHWAY IN HUMAN CELLS Integration of Multivariate Statistical Data Analysis for Spectral Data Mining and Biological Interpretation

Negli ultimi anni, la microspettroscopia a infrarosso a trasformata di Fourier (FTIR) ha acquisito crescente popolarità nelle applicazioni cliniche e farmaceutiche come metodo non distruttivo, economico e privo di etichette, impiegato negli studi preclinici, nella scoperta di nuovi farmaci, nella formulazione farmaceutica, nell’analisi farmacologica e tossicologica, nello screening diagnostico di tessuti patologici e non patologici e nell’analisi temporale di processi biologici. Di conseguenza, questa tesi si propone di esplorare e dimostrare la sua potenziale applicazione nel monitoraggio dei cambiamenti cinetici nelle cellule nel tempo, applicandola a una linea cellulare di adenocarcinoma polmonare (A549), esaminata con un focus sulla via glicolitica. L’osservazione del comportamento dinamico dei metaboliti della glicolisi, in aumento o in diminuzione, si è rivelata fondamentale per l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici in patologie come cancro, diabete, malattie neurodegenerative e aterosclerosi, in cui le cellule riprogrammano e modificano le proprie strategie energetiche. Questo tema continua tuttora a rappresentare un attivo campo di indagine scientifica. In quest’ottica, la combinazione di un approccio metabolomico, che mira ad analizzare l’intero metaboloma per fornire un quadro globale dei cambiamenti cellulari, con un approccio “spettralomico”, focalizzato invece sul monitoraggio delle sole variazioni del profilo spettrale in matrici complesse, ad esempio in funzione del tempo, si rivela particolarmente adatta per ottenere una comprensione più approfondita delle variazioni della glicolisi nel tempo delle cellule. In questo studio, le cellule A549 sono state coltivate e sottoposte a un saggio precedentemente ottimizzato in condizioni non modulate quali Condizione Blank (cellule esposte a un tampone di respirazione privo di glucosio, preparato internamente) e Condizione Controllo (lo stesso tampone arricchito con 20 mM di glucosio) e in condizioni modulate, includendo un tampone arricchito con Oligomicina per la stimolazione della glicolisi e un tampone arricchito con 2DG per la sua inibizione. L’obiettivo era confrontare l’andamento della glicolisi in queste condizioni, osservando le variazioni spettrali IR nel tempo, per mettere in evidenza i cambiamenti dinamici che avvengono nelle cellule. Inoltre, si sfrutta la capacità della microspettroscopia FTIR di ottenere immagini spettrali dell’intero campione attraverso una singola misurazione rapida e automatizzata, richiedendo una preparazione del campione minima. Questa tecnica si dimostra una valida alternativa ai numerosi saggi convenzionali, spesso costosi, laboriosi e dispendiosi in termini di tempo, quando applicati all’analisi di molteplici target. La principale sfida di questo studio consiste nel data mining del vasto set di dati spettrali IR acquisiti, al fine di estrarre e interpretare le informazioni corrispondenti ai diversi attori coinvolti nel processo e osservare come essi cambiano. Per affrontare ciò, ci si è rivolti alla Chemometria, un ramo specifico della chimica computazionale, per applicare strumenti di analisi multivariata dei dati quali il clustering K-means per classificare insiemi di dati non etichettati in gruppi, l’Analisi delle Componenti Principali (PCA) per estrarre insight biologici e ripulire il dataset da spettri non significativi, e la risoluzione di curve multivariate con minimi quadrati alternati (MCR-ALS) per estrarre informazioni cinetiche e biochimiche dei processi cellulari dipendenti dal tempo. Questo studio ha dimostrato un grande potenziale nell’investigazione della cinetica della via glicolitica, sebbene i vantaggi e le limitazioni delle tecniche applicate siano discussi nella parte finale della tesi....

In recent years, Fourier Transform Infra Red (FTIR) micro-spectroscopy has gained increasing popularity in clinical and pharmaceutical applications as a non-destructive, inexpensive, label-free method employed in preclinical studies, drug discovery, drug formulation, pharmacology and toxicology analysis, diagnostic screening of pathological and non-diseased tissue, and time-dependent analysis of biological processes. Consequently, this thesis aims to explore and demonstrate its potential application in monitoring the kinetic changes in cells over time, applying it to lung adenocarcinoma cells line (A549), examined with a focus on the glycolysis pathway. Observing the dynamic behaviour of increased or decreased glycolysis metabolites has revealed fundamental to the identification of new therapeutic targets in pathologies such as cancer, diabetes, neurodegenerative diseases and atherosclerosis, where cells reprogram and alter their energy strategies. This topic continues to represent an active field of scientific investigation. In this perspective, the combination of a metabolomic approach, which aims to analyse the entire metabolome in order to provide a global picture of cellular changes, with a “spectralomics” approach, which is focused on monitoring just the spectral profile variations in complex matrices, for example, as a function of time, is revealed to be particularly suitable for gaining deeper insights into glycolysis changes over time in cells. In this study, A549 cells were cultured and subjected to a previously optimized assay under unmodulated conditions — Blank Condition (cells exposed to glucose-free in-house prepared Respiration Buffer) and Control condition (same buffer supplemented with 20 mM glucose) — and modulated conditions, including Oligomycin-enriched buffer for stimulation of the glycolysis rate, and 2DG-enriched buffer for the inhibition. The aim was to compare the glycolysis trend across these conditions, observing IR spectral variations over time, to highlight the dynamic changes occurring in cells. Moreover, it takes advantage of the capability of FTIR micro-spectroscopy to obtain spectral images of the entire sample through a rapid and automated single measurement, requiring only a minimal sample preparation. This technique is demonstrated to be a valid alternative to multiple conventional assays which are often expensive, laborious and time-consuming, when applied for the analysis of multiple targets. The main challenge of this study is the data mining of the large IR spectral dataset acquired, in order to extract and interpret the information corresponding to the different actors involved in the process and observe how they change. To address this, a specific branch of computational chemistry, Chemometrics, was consulted to apply multivariate data analysis tools such as, K-means clustering to classify unlabelled data sets into groups, Principal Component Analysis (PCA) to extract biological insights, clean the dataset from unmeaningful spectra, and Multivariate curve resolution-alternating least squares (MCR-ALS) to extract kinetic and biochemical information of time-dependent cellular processes. This study has highlighted great potential to investigate the kinetics of the glycolysis pathway, although advantages and limitations of the techniques applied are discussed in the final part of the thesis. It delineates a set of prospective guidelines for future analysis strategies and applications of the FTIR micro-spectroscopy technique, starting from the future integration of Artificial Intelligence tools in the data mining process, and ending with the description of label-free spectroscopy as a promising, sustainable tool for the hereafter of pharmaceutical research.