SELF-ASSEMBLED LACTOFERRIN NANOPARTICLES PRODUCED VIA THERMAL DENATURATION: CHARACTERIZATION, CELL UPTAKE, AND DRUG LOADING STUDIES

L’interesse per sicurezza, efficacia e sostenibilità in ambito sanitario ha promosso l’uso di biomateriali naturali nelle applicazioni cliniche. Le sostanze naturali offrono biocompatibilità e biodegradabilità, risultando materiali ideali per la formulazione di nanosistemi per la veicolazione dei farmaci. Tuttavia, l’applicabilità a livello clinico richiede anche metodi di produzione efficienti, scalabili e sostenibili. Per favorire ciò, sono state sviluppate tecniche di produzione in grado di controllare le caratteristiche dei nanosistemi, garantire un’elevata riproducibilità e supportare l’automazione. Questi metodi contribuiscono inoltre a ridurre l’utilizzo di solventi nocivi, semplificare la produzione e facilitare l'approvazione normativa. Nei laboratori Te.Far.T.I. dell’Università di Modena e Reggio Emilia è stato ottimizzato un metodo di denaturazione termica di lattoferrina (LF) per l’autoassemblaggio di nanoparticelle (NP) destinate alla complessazione, stabilizzazione e veicolazione di siRNA. Queste NPs sono composte interamente da LF, materiale classificato come “generally recognized as safe” dalla U.S. Food and Drug Administration, e prodotte tramite un processo a singolo step, senza l’utilizzo di solventi organici. Gli studi effettuati hanno mostrato che la natura cationica e la capacità di autoassemblaggio della LF possono essere sfruttate per complessare e proteggere efficacemente molecole di siRNA, fornendo così le basi per future valutazioni in vitro. Nonostante i risultati promettenti, il comportamento biologico delle NP di LF vuote resta poco esplorato. Aspetti fondamentali come l’uptake cellulare e i potenziali effetti citotossici non sono ancora stati studiati in modo sistematico. Il primo obiettivo di questo lavoro è stato dunque conferire fluorescenza alle NP di LF tramite l’incapsulazione di fluoresceina sodica, consentendo così il loro tracciamento in studi di uptake in vitro. Le risultanti NP fluorescenti hanno mostrato dimensione inferiore a 100 nm, buona omogeneità (indice di polidispersività, PdI ~0,2) ed efficiente marcatura con il fluoroforo. Uno studio preliminare sulle cellule di microglia BV-2 ha confermato l’uptake delle NP fluorescenti, evidenziando il loro potenziale per il delivery mirato alla microglia. Inoltre, valutare la capacità delle NP di LF di incapsulare e veicolare composti con diverse proprietà chimico-fisiche è fondamentale per validarne la versatilità. Considerando che le NP di LF hanno già mostrato capacità di complessare e proteggere macromolecole di siRNA, è importante indagare come lo stesso sistema possa ospitare farmaci idrofili più piccoli. È stato quindi scelto il diclofenac sodico (DS) come composto modello per studiare l’incapsulazione di molecole a basso peso molecolare e solubili in acqua. La seconda parte di questo studio si è concentrata sull’ottimizzazione dell’auto-assemblaggio e sulla caratterizzazione delle NP di LF incapsulanti DS. Il processo di ottimizzazione, condotto testando diverse concentrazioni di DS e differenti condizioni di riscaldamento di LF, ha prodotto sospensioni di NP con elevata omogeneità dimensionale (PdI < 0,2), dimensione media compresa tra 30 e 40 nm ed efficienze di incapsulamento di DS comprese tra un 25% ed un 35%. Gli studi di stabilità durante lo stoccaggio hanno inoltre evidenziato un’ottima stabilità fisica delle formulazioni, che hanno mantenuto le proprie caratteristiche per almeno 14 giorni dopo conservazione a 4°C, a -20°C e a temperatura ambiente dopo liofilizzazione. Complessivamente, i risultati di questo studio forniscono importanti informazioni sulla formulazione, sulla stabilità e sul comportamento in vitro delle NP di LF, evidenziandone il potenziale e la versatilità come nanosistemi per la veicolazione di farmaci.

The increasing emphasis on safety, efficacy, and sustainability in healthcare has promoted interest in using natural biomaterials for clinical applications. Natural substances often offer biocompatibility and biodegradability, making them ideal materials for the formulation of drug delivery nanosystems. However, successful industrial and clinical translation demands not only functional materials but also efficient, scalable, and sustainable manufacturing methods. To meet this challenge, significant advances have been made in developing production techniques capable of precisely tuning nanosystem characteristics, ensuring high reproducibility, and supporting automation. These methods also help reduce the reliance on harmful solvents, streamline production, and facilitate regulatory approval. In this context, at the Te.Far.T.I. Nanotech Lab of the University of Modena and Reggio Emilia, researchers have optimized a thermal denaturation process for the formulation of self-assembled lactoferrin (LF)-based nanoparticles (NPs) designed for the delivery of small interfering RNA (siRNA). These NPs are composed entirely of LF, a protein classified as “generally recognized as safe” by the U.S. Food and Drug Administration, and produced via a single-step, solvent-free formulation process. Studies at the Nanotech Lab demonstrated that LF intrinsic cationic nature and self-assembly ability enable efficient siRNA complexation and protection, forming the basis for further in vitro evaluation. Despite these promising results, the biological behavior of empty LF NPs remains largely unexplored. In particular, key aspects such as cellular uptake, intracellular localization, and potential cytotoxic effects have not yet been investigated. To address this gap, the first objective of this work was to confer fluorescence to LF NPs by optimizing the encapsulation of sodium fluorescein, thus enabling their visualization and tracking in in vitro uptake studies. The resulting fluorescent LF NPs displayed a particle size below 100 nm, good homogeneity (polydispersity index, PdI ~0.2), and efficient fluorescent labeling. A preliminary uptake study in BV-2 microglial cells demonstrated the internalization of fluorescent NPs, underscoring their potential as nanosystems targeting microglia, which play a key role in several neurological diseases. Furthermore, assessing the ability of LF NPs to encapsulate and deliver compounds with diverse physicochemical properties is essential to validate their versatility. Since LF NPs have already shown the capacity to complex and protect siRNA, an anionic macromolecule, it is relevant to investigate whether the same system can load smaller hydrophilic drugs. In this context, diclofenac sodium (DS) was selected as a model compound to explore the encapsulation of low molecular weight, water soluble molecules. The second part of this study focused on optimizing the self-assembly and evaluating the physicochemical, technological, and stability properties of DS-loaded LF NPs. The optimization process, conducted by testing various DS concentrations in combination with different LF heating conditions, yielded NP suspensions with high size homogeneity (PdI < 0.2), an average size between 30 and 40 nm, and DS encapsulation efficiencies ranging from 25% to 35%. Storage stability studies further demonstrated physical stability of the formulations, which maintained their characteristics for at least 14 days when stored as liquid suspensions at 4 °C, frozen at −20 °C, or as lyophilized powders at room temperature. Collectively, the findings of this study provide valuable insights into the formulation, stability, and cellular uptake of self-assembled LF NPs, and underscore their potential as versatile nanocarriers for drug delivery.