Caratterizzazione di eteromeri di GPCRs in cellule gonadiche

L’ormone luteinizzante (LH) e la gonadotropina corionica umana (hCG) sono ormoni glicoproteici che appartengono alla famiglia delle gonadotropine e svolgono la loro funzione attraverso lo stesso recettore accoppiato a proteina G (LHCGR). LHCGR e il recettore degli estrogeni accoppiato a proteina G (GPER) sono co-espressi nelle gonadi, dove regolano la gametogenesi. Studi precedenti hanno dimostrato che GPER è in grado di formare complessi eteromerici con i recettori delle gonadotropine, riprogrammando segnali proliferativi e anti-apoptotici. In cellule HEK293 trasfettate, la co-espressione di GPER e LHCGR inibisce l’attivazione LH/hCG-dipendente della pathway mediata dalla proteina Gq e la proliferazione cellulare. Lo scopo di questo progetto è valutare come la formazione di eteromeri LHCGR/GPER possa modulare segnali LH/hCG-dipendenti, in cellule gonadiche esprimenti endogenamente entrambi i recettori. Gli esperimenti sono stati svolti utilizzando cellule tumorali di Leydig murine (mLTC-1) e cellule umane della granulosa luteiniche (hGLCs), nelle quali è stata indotta l’over-espressione di GPER, rispettivamente in forma murina e umana, mediante trasfezione. I livelli di espressione dei geni codificanti le proteine Gs e Gq (GNAS e GNAQ) e i recettori (LHCGR e GPER) sono stati quantificati mediante droplet digital PCR (ddPCR), mentre l’interazione tra i due recettori è stata valutata mediante proximity ligation assay (PLA). L’espressione di GPER esogeno, ottenuta in seguito a trasfezione, è stata invece valutata mediante Western blotting. Le cellule sono state trattate con LH e hCG e sono stati valutati l’aumento intracellulare di ioni calcio (Ca2+) mediante bioluminescence resonance energy transfer (BRET), di cAMP e inositolo monofosfato (IP1) e la produzione di testosterone mediante homogenous time resolved fluorescence (HTRF). Sono state inoltre valutate la vitalità cellulare mediante saggio 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) e la proliferazione cellulare mediante BrdU assay, in presenza o in assenza di pre-incubazione con l’inibitore di Gq. Le analisi di espressione genica hanno confermato la presenza dei trascritti LHCGR e GPER in entrambe le linee cellulari, mostrando un incremento del loro livello di espressione in seguito a trasfezione. L’efficienza di trasfezione di GPER è stata confermata anche mediante Western blotting. Gli esperimenti di PLA hanno evidenziato la presenza di eteromeri LHCGR/GPER sulla superficie cellulare di mLTC-1 e hGLCs. Tuttavia, la co-espressione dei recettori non modula la via LH/hCG-dipendente mediata dalla proteina Gq, la quale non viene attivata significativamente dal trattamento con le due gonadotropine. In entrambe le linee cellulari, i livelli di espressione del gene codificante la proteina Gs sono risultati superiori rispetto a quelli della proteina Gq, suggerendo un accoppiamento preferenziale di LHCGR con Gs. Infatti, il trattamento con LH e hCG induce accumulo intracellulare di cAMP e produzione di testosterone, ma non aumento intracellulare di Ca2+ e IP1. Inoltre, l’inibitore di Gq non è stato in grado di diminuire la vitalità e la proliferazione cellulare. In cellule over-esprimenti la proteina Gq, invece, è stato osservato accumulo intracellulare di IP1. In conclusione, i risultati ottenuti dimostrano l’interazione tra GPER e LHCGR sia in cellule di Leydig che in cellule della granulosa. Tuttavia, la co-espressione recettoriale non influenza l’attivazione delle pathway mediate da Gs e da Gq e, in particolare, l’attivazione di quest’ultima è inibita dall’accoppiamento preferenziale di LHCGR con Gs.