OPTIMISATION OF THE SYNTHESIS PROCESS OF PLGA-AAVF2 FOR THE FORMULATION OF SEVERAL NANOPARTICLES FOR BRAIN-DELIVERY

Negli ultimi anni, lo sviluppo di sistemi a base di nanoparticelle ha aperto nuove prospettive per la veicolazione mirata di farmaci al cervello, superando le limitazioni imposte dalla barriera emato-encefalica (BEE). In questo contesto, la funzionalizzazione delle nanoparticelle con ligandi specifici, come i peptidi, rappresenta una strategia promettente per migliorare l’accumulo a livello cerebrale. In questo studio, sono stati ottimizzati i protocolli di sintesi per la funzionalizzazione di PLGA e CHOL-PEG1000 con il peptide AAVF2 (peptide virale associato ad adenovirus 2), il quale è caratterizzato da una specifica sequenza, PEG-FVVGQSQ-CONH₂, in grado di attraversare la BEE. Per questo motivo è stato scelto per studiare le strategie di coniugazione e la funzionalizzazione delle nanoparticelle. Partendo da metodi già validati in laboratorio, sono state introdotte diverse ottimizzazioni: riduzione dei tempi di reazione, semplificazione delle procedure di purificazione mediante filtrazione su membrana PTFE e analisi di differenti condizioni di solvente e temperatura. La coniugazione PLGA-AAVF2 è stata ottenuta con successo, consentendo la formulazione di nanoparticelle polimeriche sia con solo PLGA sia PLGA-AAVF2 con diverse percentuali di peptide. In particolare, la coniugazione di CHOL-PEG1000 con AAVF2 ha richiesto ulteriori strategie, tra cui l’uso di miscele di solventi, la correzione dei rapporti stechiometrici e l’attivazione termica a 45 °C, per affrontare problemi di solubilità e bassi rendimenti. Tuttavia, nonostante i numerosi tentativi, la reazione di coniugazione non è stata ottenuta. Per questo motivo le nanoparticelle lipidiche sono state formulate con solo CHOL, senza funzionalizzazione peptidica. Infine, combinando i materiali utilizzati nei due sistemi, sono state prodotte nanoparticelle ibride basate sulle coniugazioni effettivamente disponibili. Le formulazioni sono state caratterizzate in termini di distribuzione dimensionale, indice di polidispersità, potenziale zeta e stabilità, per valutare l’idoneità alla veicolazione cerebrale. L’ottimizzazione dei processi sintetici ha portato a un netto miglioramento delle rese di coniugazione per PLGA-AAVF2 e allo sviluppo di nanoparticelle stabili. I risultati costituiscono una solida base per futuri sviluppi di sistemi di veicolazione cerebrale, con applicazioni nella medicina personalizzata e nell’integrazione in dispositivi avanzati per la somministrazione controllata dei farmaci. Inoltre, lo studio propone un metodo di produzione che, con opportuni adattamenti, potrà essere trasferito a sistemi automatizzati di microfluidica, rendendolo interessante anche in prospettiva industriale.

In recent years, the development of nanoparticle-based systems has opened new perspectives for brain-targeted drug delivery, overcoming the limitations posed by the blood-brain barrier (BBB). In this context, the functionalization of nanoparticles with specific ligands, such as peptides, represents a promising strategy to obtain peptide-conjugated components that can subsequently be incorporated into nanoparticle formulations to enhance brain uptake. In this study, synthetic protocols for the functionalization of PLGA and CHOL-PEG1000 with the peptide AAVF2 (adeno-associated viral peptide 2) were optimized to improve conjugation efficiency and process reproducibility. AAVF2 is characterized by the sequence PEG-FVVGQSQ-CONH₂ and, based on its structural features and origin, it is itself likely capable of crossing the BBB. For this reason, it was selected to study conjugation strategies and nanoparticle functionalization. Starting from laboratory-validated methods, several optimizations were successfully introduced for PLGA–AAVF2 conjugation, including the reduction of activation and conjugation times, simplification of purification steps, and exploration of different solvent systems and reaction conditions. Since this conjugation was successfully achieved, polymeric nanoparticles (PNPs) were formulated both as full-PLGA nanoparticles and as PLGA-AAVF2 nanoparticles with different percentages of peptide functionalization. Conversely, the conjugation of CHOL-PEG1000 with AAVF2 required additional optimization steps such as the use of solvent mixtures, adjustment of stoichiometric ratios, and thermal activation at 45 °C to address solubility issues and low reaction yields; however, despite multiple attempts and modifications, the reaction could not be successfully achieved. For this reason, lipid nanoparticles (LNPs) were prepared as full-cholesterol formulations without AAVF2 functionalization. Finally, combining the materials used in both the polymeric and lipid systems, polymeric–lipid hybrid nanoparticles (PLHNPs) were formulated using both PLGA/PLGA-AAVF2 and CHOL components, based on the successful conjugations available. Formulations were characterized by size, PDI (polydispersity index), zeta potential, and stability analysis to evaluate their suitability for brain delivery applications. Optimisation of the synthetic processes led to significantly improved conjugation yields for PLGA-AAVF2 and the development of stable nanoparticle platforms. These findings provide a solid foundation for future development of brain targeted delivery systems, with the potential for translation into personalized therapeutic approaches and integration into advanced technological drug delivery devices. This study also presents an initial production method that, with specific adjustments, can be adapted to automated microfluidics, making it appealing for potential industrial-scale production.