Challenging chemotherapy resistance: insights into combinational inhibition of thymidylate synthase (hTS) and YAP/TEAD complex in 5-FU resistant colorectal cancer cells

Il cancro colorettale (CRC) rimane una sfida clinica significativa a livello mondiale, ulteriormente aggravata dall'aumento dell'incidenza dei casi a esordio precoce (sotto i 50 anni). Nonostante i notevoli progressi ottenuti grazie allo sviluppo di terapie mirate e dell'immunoterapia, l'emergere di resistenze alle diverse strategie terapeutiche disponibili continua a rappresentare un'importante limitazione e una sfida continua nella ricerca sul cancro. Il 5-fluorouracile (5-FU) è un chemioterapico ampiamente utilizzato nel trattamento del cancro colorettale, solitamente in combinazione con altri farmaci, come nei regimi FOLFOX (acido folinico, 5-FU e oxaliplatino) e FOLFIRI (acido folinico, 5-FU e irinotecano). Uno dei principali meccanismi alla base dell'attività antitumorale del 5-FU coinvolge l'inibizione della timidilato sintetasi umana (hTS), un enzima chiave nella biosintesi del DNA, che agisce come omodimero. È noto che le cellule tumorali che sviluppano resistenza al 5-FU sovraesprimono frequentemente questo enzima, riducendo così la sua efficacia terapeutica. Di conseguenza, la timidilato sintasi è emersa come un potenziale bersaglio per superare lo sviluppo di tale resistenza. Poiché l'hTS agisce come dimero, abbiamo sviluppato composti chiamati 'dimer disrupters' (E7 e i suoi derivati), che agiscono sull'interfaccia monomero-monomero (nuovo meccanismo molecolare), inibendo la dimerizzazione e quindi ostacolando l'attività di questo enzima. Inoltre, una via emergente deregolata nel CRC è la Hippo pathway (HP), che ha YAP/TAZ/TEAD come principali effettori. È noto che la segnalazione HP deregolata è coinvolta nello sviluppo tumorale, poiché l'iperattività di YAP è correlata a una maggiore resistenza a diversi agenti chemioterapici, incluso il 5-FU. Pertanto, per migliorare l'efficacia del trattamento del CRC, abbiamo impiegato il bersaglio terapeutico YAP/TEAD utilizzando il nostro composto (6a) che agisce per interrompere il complesso YAP/TEAD (Scalvini L et al., 2025). In questo rapporto, abbiamo stabilito una linea cellulare di CRC resistente al 5-FU (HCT116/5FU) e abbiamo esaminato i ruoli di hTS e YAP/TEAD nello sviluppo di resistenza al 5-FU. Abbiamo mostrato che le cellule HCT116/5FU presentavano livelli aumentati di hTS e geni target YAP/TEAD upregolati (CYR61, CTGF). Abbiamo scoperto che l'inibizione combinata del complesso YAP/TEAD tramite il composto 6a e un derivato di E7 (E7dvti_1, disgregatore del dimero hTS) sopprimeva sinergicamente la crescita delle cellule CRC (Synergy Finder). È importante notare che l'effetto sinergico era accompagnato da una maggiore riduzione della proteina hTS e dall'inibizione del complesso YAP/TEAD rispetto all'uso dei singoli farmaci 6a ed E7dvti_1. Infine, abbiamo riscontrato che l'inibizione combinata di hTS e YAP/TEAD invertiva la resistenza a 5-Fu nella linea cellulare HCT116/5FU. Nel complesso, i nostri risultati hanno evidenziato una nuova strategia terapeutica, tramite una combinazione di inibitori mirati a hTS e YAP/TEAD, per sopprimere e invertire la resistenza alla chemioterapia nel cancro del colon-retto.

Colorectal cancer (CRC) remains a significant clinical challenge worldwide, further exacerbated by the increase in the incidence of early-onset cases (under 50 y/o). Despite considerable progress achieved through the development of targeted therapies and immunotherapy, the emergence of resistance to the various therapeutic strategies available continues to represent a major limitation and an ongoing challenge in cancer research. 5-fluorouracil (5-FU) is a chemotherapic widely used in the treatment of colorectal cancer, usually in combination with other drugs, such as FOLFOX (folinic acid, 5-FU and oxaliplatin) and FOLFIRI (folinic acid, 5-FU and irinotecan) regimens. One of the main mechanisms underlying 5-FU antitumor activity involves the inhibition of human thymidylate synthase (hTS), a key enzyme of DNA biosynthesis, which acts as a homodimer. It is well known that cancer cells that develop resistance to 5-FU frequently overexpress this enzyme, thereby reducing its therapeutic efficacy. Consequently, thymidylate synthase has emerged as a potential target for overcoming the development of such resistance. Since hTS acts as a dimer, we have developed compounds called ‘dimer disrupters’ (E7 and its derivatives), which act on the monomer-monomer interface (novel molecular mechanism), inhibiting dimerization and thus hindering the activity of this enzyme. Furthermore, an emerging pathway deregulated in CRC is the Hippo Pathway (HP), which has YAP/TAZ/TEAD as its main effectors. It is known that dysregulated HP signalling is involved in tumor development, as YAP hyperactivity correlates with increased resistance to various chemotherapeutic agents, including 5-FU. As such, to improve the efficacy of CRC treatment, we employed the YAP/TEAD therapeutic target using our compound (6a) that acts to disrupt the YAP/TEAD complex (Scalvini L et al., 2025). In this report, we established a 5-FU-resistant CRC cell line (HCT116/5FU) and examined the roles of hTS and YAP/TEAD in chemotherapy resistance. We showed that HCT116/5FU cells displayed increased hTS levels and upregulated YAP/TEAD target genes (CYR61, CTGF). We found that combinational inhibition of the YAP/TEAD complex by 6a compound and an E7 derivative (E7dvti_1, hTS dimer disrupter) synergistically suppressed CRC cell growth (Synergy Finder). Notably, the synergistic effect was accompanied by a higher hTS protein reduction and YAP/TEAD complex inhibition compared to 6a and E7dvti_1 used as a single drug. Finally, we found that combinational inhibition of hTS and YAP/TEAD reversed 5-Fu resistance in the HCT116/5FU cell line. Overall, our results highlighted a novel therapeutic strategy, through a combination of inhibitors targeting hTS and YAP/TEAD, to suppress and reverse chemotherapy resistance in colorectal cancer.