Identification and differential usage analysis of isoforms in doxorubicin-induced senescence model using third-generation sequencing

Lo splicing alternativo è un meccanismo regolatorio chiave che consente a un singolo gene di generare molteplici isoforme trascrizionali, ampliando così la diversità proteomica. Le alterazioni dello splicing sono state associate alla compromissione della funzione proteica e all’insorgenza di fenotipi patologici, inclusi quelli legati all’invecchiamento e alla senescenza cellulare. In particolare, alterazioni dell’attività dei fattori di splicing associate all’età possono portare all’espressione aberrante di isoforme, contribuendo potenzialmente alla disfunzione tissutale indotta dalla senescenza. In questo studio, l’espressione di isoforme alternative è stata analizzata mediante sequenziamento RNA long-read in un modello cellulare di senescenza. La senescenza è stata indotta in cellule HEK293 tramite trattamento con 30 nM di doxorubicina per cinque giorni. L’instaurarsi di un fenotipo senescente stabile è stato confermato mediante saggi di vitalità cellulare, saggi di senescenza e la quantificazione dei principali marcatori di senescenza. Inoltre, l’arresto del ciclo cellulare è stato monitorato in tempo reale utilizzando il sistema FUCCI, validando ulteriormente lo stato senescente. Il profilo trascrittomico è stato ottenuto utilizzando il sequenziamento long-read di Oxford Nanopore, che consente il sequenziamento a lunghezza intera delle isoforme senza la necessità di ricostruzione dei trascritti. Una pipeline bioinformatica dedicata, implementata in ambiente R e basata sul pacchetto bambu, ha permesso l’annotazione e la quantificazione sia di isoforme note sia di isoforme nuove, portando all’identificazione di 4.524 trascritti precedentemente non annotati. Le analisi di espressione differenziale a livello dei geni e dei trascritti sono state condotte utilizzando DESeq2, mentre l’analisi dell’uso differenziale dei trascritti (DTU) è stata effettuata con DEXSeq per identificare eventi di switching delle isoforme. L’analisi DTU ha rivelato 1.040 geni che mostrano fenomeni di switching, coinvolgendo 1.794 trascritti. Tra questi geni, 544 presentano DTU in assenza di variazioni significative dell’espressione complessiva del gene o dei trascritti. Le analisi di arricchimento funzionale hanno evidenziato che i geni che mostrano uso differenziale dei trascritti sono prevalentemente associati a processi correlati all'assemblaggio e all'organizzazione del ciglio, autofagia e mitofagia, nonché a vie regolatorie coinvolte nella modificazione proteica e in complessi cellulari associati all’RNA. Infine, l’integrazione con il database CellAge ha evidenziato 12 nuovi trascritti derivanti da geni con ruoli consolidati nella regolazione della senescenza. Nel complesso, questi risultati dimostrano che il rimodellamento trascrizionale associato alla senescenza va oltre la semplice espressione genica differenziale e sottolineano l’importanza dell’analisi dello splicing alternativo per una caratterizzazione completa della senescenza cellulare.

Alternative splicing is a key regulatory mechanism that enables a single gene to generate multiple transcript isoforms, thereby expanding proteomic diversity. Dysregulation of splicing has been associated with impaired protein function and the onset of pathological phenotypes, including those related to aging and cellular senescence. Indeed, age-associated alterations in splicing factor activity can lead to aberrant isoform expression, potentially contributing to senescence-driven tissue dysfunction. In this study, alternative isoform expression was investigated by performing long-read RNA sequencing in a cellular model of senescence. Senescence was induced in HEK293 cells through treatment with 30 nM doxorubicin for five days. The establishment of a stable senescent phenotype was confirmed using viability assays, senescence assays, and the quantification of key senescence markers. In addition, cell cycle arrest was monitored in real time using the FUCCI system, further validating the senescent state. Transcriptomic profiling was performed using Oxford Nanopore long-read sequencing, enabling full-length sequencing of isoforms without the need for transcript reconstruction. A dedicated bioinformatic pipeline implemented in the R environment and based on the bambu package allowed the annotation and quantification of both known and novel isoforms, leading to the identification of 4,524 previously unannotated transcripts. Differential expression analyses at the gene and transcript levels were conducted using DESeq2, while differential transcript usage (DTU) analysis was performed with DEXSeq to identify isoform switching events. DTU analysis revealed 1,040 genes exhibiting isoform switching involving 1,794 transcripts. Among these genes, 544 showed DTU without significant changes in overall gene or transcript expression. Functional enrichment analyses revealed that genes exhibiting differential transcript usage were predominantly associated with processes related to cilium assembly and organization, autophagy and mitophagy, as well as regulatory pathways related to protein modification and RNA-associated cellular complexes. Finally, integration with the CellAge database highlighted 12 newly identified transcripts derived from genes with established roles in senescence regulation. Overall, these results demonstrate that senescence-associated transcriptional remodeling extends beyond differential gene expression and underscore the importance of alternative splicing analysis for a comprehensive characterization of cellular senescence.