La transizione verso la cromatografia liquida capillare (micro-HPLC) rappresenta una risposta fondamentale alle esigenze della moderna chimica analitica "green", permettendo un’elevata sensibilità in campioni a volume limitato e una drastica riduzione del consumo di solventi. Rispetto alle colonne impaccate convenzionali, i supporti monolitici polimerici offrono una rete interconnessa di macropori che garantisce un’elevata permeabilità idrodinamica. Tuttavia, l'analisi di matrici biologiche complesse richiede fasi stazionarie capaci di risolvere analiti con polarità molto diverse. Il monitoraggio clinico del paracetamolo è reso difficile dalla necessità di separare simultaneamente la molecola madre dai suoi metaboliti altamente idrofili, sfida che richiede una progettazione molecolare precisa della matrice polimerica. La presente tesi sperimentale si è concentrata sulla sintesi e sulla caratterizzazione di una libreria di nove colonne monolitiche per identificare la correlazione tra struttura chimica e prestazioni cromatografiche. Per valutarne l’integrità strutturale e l’efficienza, è stata condotta una caratterizzazione cinetica preliminare mediante l’analisi di una serie omologa di alchilbenzeni allo scopo di valutare la risposta complessiva del sistema in termini di allargamento delle bande cromatografiche (hydrodynamic stress test), piuttosto che l’identificazione qualitativa dei singoli componenti. Inoltre, ha consentito di escludere le matrici potenzialmente instabili dal punto di vista morfologico prima di procedere all’analisi dei metaboliti polari. I risultati hanno evidenziato andamenti distinti per ogni classe di cross-linker: • Serie Glicolica (Ethylene glycol dimethacrylate (EDMA), Triethylene glycol dimethacrylate (TriEDMA), Tetraethylene glycol dimethacrylate (TeEDMA)): l’omogeneità strutturale migliora con l’aumento della lunghezza della catena ossietilenica. TeEDMA ha mostrato la migliore efficienza cinetica e bassi valori di HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate). • Serie Alifatica (Butane-1,3-diol dimethacrylate (1,3-BUDMA), Tetramethylene dimethacrylate (1,4-BUDMA), Hexamethylene dimethacrylate (HEDMA), Decane-1,10-diol dimethacrylate (DeEDMA)): l’uso di spacer alchilici ha generato strutture meno organizzate e all’aumentare dell’idrofobicità (catene C6 e C10) è stato osservato un deterioramento del trasferimento di massa per molecole di piccole dimensioni. Il 1,4-BUDMA è risultato enigmatico, mostrando macropori sovradimensionati e instabilità cinetica nonostante bassi valori teorici di HETP. • Serie Aromatiche/Multifunzionali (1,4-Phenylene dimethacrylate (PhDMA), Pentaerythritol triacrylate (PETRA)): hanno mostrato difetti strutturali quali distacchi dalla parete (wall-effect) o formazione di reti incoerenti e fratturate. Sulla base dei risultati ottenuti, le colonne TeEDMA, TriEDMA e 1,4-BUDMA sono state selezionate per la separazione del Paracetamolo e dei suoi principali metaboliti polari: acetaminofene-cisteina, acetaminofene-N-acetilcisteina e acetaminofene-glutatione. I test finali hanno confermato la superiorità della fase stazionaria TeEDMA, capace di stabilire un'interazione più forte con i coniugati polari. In una prospettiva futura, l'ottimizzazione del gradiente di eluizione e della forza ionica della fase mobile permetterà di trasformare questi prototipi in strumenti diagnostici avanzati. La modulazione della catena del cross-linker si conferma lo strumento principale per ingegnerizzare fasi stazionarie monolitiche di nuova generazione, aprendo la strada a sistemi micro-fluidici integrati per il monitoraggio terapeutico "point-of-care" e analisi bioanalitiche rapide ad alta risoluzione.
The transition toward capillary liquid chromatography (micro-HPLC) represents a fundamental response to the requirements of modern "green" analytical chemistry, enabling high sensitivity in volume-limited samples and a drastic reduction in solvent consumption. Compared to conventional packed columns, polymeric monolithic supports offer an interconnected network of macropores that ensures high hydrodynamic permeability. However, the analysis of complex biological matrices requires stationary phases capable of resolving analytes with widely varying polarities. Clinical monitoring of acetaminophen is hindered by the need to simultaneously separate the parent molecule from its highly hydrophilic metabolites, a challenge that requires precise molecular engineering of the polymeric matrix. This experimental thesis focused on the synthesis and characterization of a library of nine monolithic columns to identify the correlation between chemical structure and chromatographic performance. To validate their structural integrity and efficiency, a preliminary kinetic characterization was conducted analyzing a homologous series of alkylbenzenes. This approach was aimed to evaluate the overall system response in terms of chromatographic band broadening (hydrodynamic stress-test), rather than to enable the qualitative identification of individual components. It also allowed the exclusion of potentially morphologically unstable matrices before proceeding to the analysis of polar metabolites. The results highlighted distinct trends for each cross-linker class: • Glycol Series (Ethylene glycol dimethacrylate (EDMA), Triethylene glycol dimethacrylate (TriEDMA), Tetraethylene glycol dimethacrylate (TeEDMA)): structural homogeneity improved with increasing oxyethylene chain length. TeEDMA exhibited the best kinetic efficiency and low HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate) values. • Aliphatic Series (Butane-1,3-diol dimethacrylate (1,3-BUDMA), Tetramethylene dimethacrylate (1,4-BUDMA), Hexamethylene dimethacrylate (HEDMA), Decane-1,10-diol dimethacrylate (DeEDMA)): the use of alkyl spacers generated less organized structures; as hydrophobicity increased (C6 and C10 chains), a deterioration in mass transfer was observed for small molecules. 1,4-BUDMA proved to be an enigmatic case, showing oversized macropores and kinetic instability despite low theoretical HETP values. • Aromatic and Multifunctional Series (1,4-Phenylene dimethacrylate (PhDMA), Pentaerythritol triacrylate (PETRA)): these led to structural failures such as detachment from the capillary wall (wall-effect) or incoherent and fractured networks. Based on these results, TeEDMA, TriEDMA, and 1,4-BUDMA columns were selected for the separation of acetaminophen and its main polar metabolites: acetaminophen-cysteine, acetaminophen-N-acetylcysteine, and acetaminophen-glutathione. Final tests confirmed the superiority of the TeEDMA stationary phase, which exhibited stronger and more stable interactions with polar conjugates. In a future perspective, the optimization of the elution gradient and the ionic strength of the mobile phase will allow these prototypes to be transformed into advanced diagnostic tools. The modulation of the cross-linker chain is confirmed as a key strategy for engineering next-generation monolithic stationary phases, paving the way for integrated microfluidic systems for point-of-care therapeutic monitoring and high-resolution, rapid bioanalytical analysis.
Development and optimization of polymer-based monolithic capillary columns for micro-HPLC analyses
ANGHINOLFI, CHIARA
2024/2025
Abstract
La transizione verso la cromatografia liquida capillare (micro-HPLC) rappresenta una risposta fondamentale alle esigenze della moderna chimica analitica "green", permettendo un’elevata sensibilità in campioni a volume limitato e una drastica riduzione del consumo di solventi. Rispetto alle colonne impaccate convenzionali, i supporti monolitici polimerici offrono una rete interconnessa di macropori che garantisce un’elevata permeabilità idrodinamica. Tuttavia, l'analisi di matrici biologiche complesse richiede fasi stazionarie capaci di risolvere analiti con polarità molto diverse. Il monitoraggio clinico del paracetamolo è reso difficile dalla necessità di separare simultaneamente la molecola madre dai suoi metaboliti altamente idrofili, sfida che richiede una progettazione molecolare precisa della matrice polimerica. La presente tesi sperimentale si è concentrata sulla sintesi e sulla caratterizzazione di una libreria di nove colonne monolitiche per identificare la correlazione tra struttura chimica e prestazioni cromatografiche. Per valutarne l’integrità strutturale e l’efficienza, è stata condotta una caratterizzazione cinetica preliminare mediante l’analisi di una serie omologa di alchilbenzeni allo scopo di valutare la risposta complessiva del sistema in termini di allargamento delle bande cromatografiche (hydrodynamic stress test), piuttosto che l’identificazione qualitativa dei singoli componenti. Inoltre, ha consentito di escludere le matrici potenzialmente instabili dal punto di vista morfologico prima di procedere all’analisi dei metaboliti polari. I risultati hanno evidenziato andamenti distinti per ogni classe di cross-linker: • Serie Glicolica (Ethylene glycol dimethacrylate (EDMA), Triethylene glycol dimethacrylate (TriEDMA), Tetraethylene glycol dimethacrylate (TeEDMA)): l’omogeneità strutturale migliora con l’aumento della lunghezza della catena ossietilenica. TeEDMA ha mostrato la migliore efficienza cinetica e bassi valori di HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate). • Serie Alifatica (Butane-1,3-diol dimethacrylate (1,3-BUDMA), Tetramethylene dimethacrylate (1,4-BUDMA), Hexamethylene dimethacrylate (HEDMA), Decane-1,10-diol dimethacrylate (DeEDMA)): l’uso di spacer alchilici ha generato strutture meno organizzate e all’aumentare dell’idrofobicità (catene C6 e C10) è stato osservato un deterioramento del trasferimento di massa per molecole di piccole dimensioni. Il 1,4-BUDMA è risultato enigmatico, mostrando macropori sovradimensionati e instabilità cinetica nonostante bassi valori teorici di HETP. • Serie Aromatiche/Multifunzionali (1,4-Phenylene dimethacrylate (PhDMA), Pentaerythritol triacrylate (PETRA)): hanno mostrato difetti strutturali quali distacchi dalla parete (wall-effect) o formazione di reti incoerenti e fratturate. Sulla base dei risultati ottenuti, le colonne TeEDMA, TriEDMA e 1,4-BUDMA sono state selezionate per la separazione del Paracetamolo e dei suoi principali metaboliti polari: acetaminofene-cisteina, acetaminofene-N-acetilcisteina e acetaminofene-glutatione. I test finali hanno confermato la superiorità della fase stazionaria TeEDMA, capace di stabilire un'interazione più forte con i coniugati polari. In una prospettiva futura, l'ottimizzazione del gradiente di eluizione e della forza ionica della fase mobile permetterà di trasformare questi prototipi in strumenti diagnostici avanzati. La modulazione della catena del cross-linker si conferma lo strumento principale per ingegnerizzare fasi stazionarie monolitiche di nuova generazione, aprendo la strada a sistemi micro-fluidici integrati per il monitoraggio terapeutico "point-of-care" e analisi bioanalitiche rapide ad alta risoluzione.| File | Dimensione | Formato | |
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