UNVEILING THE PROTEIN CORONA: ADDRESSING PROTOCOL CHALLENGES IN ADVANCED NANOMATERIAL TOXICITY ASSESSMENT ACROSS BIOLOGICAL FLUIDS

I nanomateriali avanzati (Ad-NMs) sono sempre più impiegati in una vasta gamma di settori, tra cui la medicina, le applicazioni ambientali e i prodotti di consumo. Tuttavia, la rapida espansione delle loro applicazioni solleva significative preoccupazioni riguardo alla loro potenziale tossicità e all’impatto ambientale. Nonostante la disponibilità di diversi quadri normativi e linee guida per i test, la caratterizzazione dei nanomateriali in condizioni di esposizione realistiche rimane una limitazione rilevante. Una questione chiave è la mancanza di metodi standardizzati per valutare il comportamento degli Ad-NMs in sistemi biologici o ambientali complessi, nei quali essi subiscono trasformazioni dinamiche che ne modificano profondamente le proprietà superficiali. All’ingresso in un mezzo biologico, i nanomateriali vengono rivestiti da uno strato di biomolecole, principalmente proteine, ma anche lipidi e glicani, formando la cosiddetta corona biomolecolare. Questa struttura ridefinisce l’identità biologica del nanomateriale e ne governa le interazioni con cellule e tessuti. La corona biomolecolare è comunemente suddivisa in due componenti: una soft corona dinamica e debolmente legata, e una hard corona più stabile e fortemente adsorbita. Sebbene la proteomica rimanga lo strumento principale per l’analisi della corona biomolecolare, ricerche recenti evidenziano l’importanza di altri componenti, come i glicani, che possono influenzare significativamente la stabilità colloidale e il riconoscimento biologico. Gli attuali protocolli di nanotossicologia in vitro spesso trascurano variabili chiave, come l’origine del siero utilizzato nei mezzi di prova. Ad esempio, il siero fetale bovino è comunemente aggiunto ai terreni di coltura cellulare per supportare la crescita cellulare, ma la sua composizione proteica differisce marcatamente da quella del siero umano. Questa discrepanza può introdurre un bias xenogenico nelle interazioni tra nanoparticelle e cellule, limitando la rilevanza dei dati in vitro per la valutazione del rischio per la salute umana. Inoltre, i profili di glicosilazione derivati dal siero variano ampiamente tra le specie e possono modulare l’assorbimento delle nanoparticelle e il riconoscimento immunitario. Un altro fattore critico nella nanotossicologia è lo stato di dispersione dei nanomateriali nei mezzi di prova. Una dispersione inadeguata può portare ad agglomerazione o flottazione, alterando la dose effettiva somministrata alle cellule. Questo aspetto è particolarmente rilevante per materiali idrofobici o a bassa densità, come alcuni nanomateriali a base di carbonio quali l’ossido di grafene o alcune micro- e nanoplastiche. In sintesi, la crescente complessità strutturale e diversità dei nanomateriali richiede strategie di test più adattabili e accurate. Ciò include il perfezionamento dei protocolli di dispersione, la rivalutazione dell’uso di sieri di origine animale e l’estensione della caratterizzazione della corona per includere la glicosilazione. Affrontando queste lacune, sarà possibile progredire verso valutazioni di nanosicurezza più predittive ed eticamente responsabili, meglio allineate con scenari di esposizione reali e con i principi delle 3R (Replacement, Reduction, Refinement).

Advanced nanomaterials (Ad-NMs) are increasingly employed in a variety of sectors, including medicine, environmental applications, and consumer products. However, the rapid expansion of their applications raises significant concerns regarding their potential toxicity and environmental impact. Despite the availability of several regulatory frameworks and testing guidelines, the characterization of NMs under realistic exposure conditions remains a major limitation. One key issue is the lack of standardized methods for evaluating the behaviour of Ad-NMs in complex biological or environmental systems, where they undergo dynamic transformations that profoundly alter their surface properties. Upon entering a biological medium, NMs become coated by a layer of biomolecules, primarily proteins, but also lipids and glycans, forming the so-called biomolecular corona. This structure redefines the NM’s biological identity and governs its interactions with cells and tissues. The biomolecular corona is commonly divided into two components: a dynamic, loosely bound soft corona, and a more stable, tightly adsorbed hard corona. While proteomics remains the primary tool for biomolecular corona analysis, recent research highlights the importance of other components such as glycans, which can significantly influence colloidal stability and biological recognition. Current in vitro nanotoxicology protocols often overlook key variables such as the origin of serum used in the testing media. For instance, fetal bovine serum is routinely added to cell culture media to support cell growth, but its protein composition differs markedly from human serum. This mismatch can introduce a xenogeneic bias in nanoparticle-cell interactions, limiting the relevance of in vitro data for human health risk assessment. Furthermore, serum-derived glycosylation profiles differ widely across species and may modulate nanoparticle uptake and immune recognition. Another critical factor in nanotoxicology is the dispersion state of NMs in test media. Improper dispersion can lead to agglomeration or flotation, which alters the effective dose delivered to cells. This issue is particularly relevant for hydrophobic or low-density materials such as certain carbon-based nanomaterials like graphene oxide or some micro and nanoplastics. In summary, the growing structural complexity and diversity of NMs demand more adaptable and accurate testing strategies. This includes refining dispersion protocols, re-evaluating the use of animal-derived sera, and expanding corona characterization to include glycosylation. By addressing these gaps, we can move toward more predictive and ethically responsible nanosafety assessments that are better aligned with real-world exposure scenarios and the principles of the 3Rs (Replacement, Reduction, Refinement).