Modulazione dell'espressione di Periostina nelle cellule tumorali dell'adenocarcinoma duttale pancreatico mediante editing genetico CRISPR/Cas9

L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) rappresenta la quarta causa di morte per cancro in Italia, con una sopravvivenza a cinque anni dalla diagnosi dell’11% per gli uomini e del 12% per le donne. Questa patologia è caratterizzata da una forte reazione desmoplastica, in cui la componente non maligna del tumore, detta stroma, costituisce fino all'80% della neoplasia. Lo stroma riveste un ruolo rilevante nella biologia del PDAC poiché, attraverso lo scambio di un complesso network di citochine e fattori di segnalazione scambiati con le cellule maligne, favorisce la crescita tumorale e la resistenza alle terapie. Fra i mediatori dell’interazione stroma-tumore troviamo Periostina (POSTN), una proteina secreta sia dalle cellule stromali che dalla componente maligna. POSTN nel microambiente tumorale promuove la stabilizzazione della matrice extracellulare (ECM), supporta la proliferazione delle cellule tumorali e media segnali di resistenza ad apoptosi mediante l’interazione con le integrine αvβ3, αvβ5 e α6β4 con conseguente attivazione di diversi pathway, tra cui PI3K/AKT. In questo studio è stato effettuato il knockout di POSTN (POSTN-KO) nella linea cellulare di PDAC HS766T utilizzando una strategia basata sul sistema CRISPR/Cas9 integrato stabilmente nel genoma delle cellule tumorali a seguito di trasduzione di vettori lentivirali LV-CRISPR, il gene per la Green Fluorescent Protein (GFP) e la specifica guida a RNA (gRNA). Sono state così generate tre linee POSTN-KO: due mediante un vettore lentivirale contenente un singolo RNA guida (gRNA1) e una ottenuta con un vettore esprimente la combinazione di due RNA guida (gRNA1 e gRNA3). L’efficienza di trasduzione e la stabilità dell’integrazione sono state monitorate nel tempo valutando la positività delle cellule alla GFP mediante analisi citofluorimetrica. Successivamente è stata studiata l’efficacia del gene editing attraverso analisi TIDE, determinando le percentuali di INDELs ottenuti nelle diverse linee. La caratterizzazione molecolare in vitro ha confermato la significativa riduzione dei livelli di espressione di POSTN nelle linee POSTN-KO rispetto al controllo wild type (WT). Dal punto di vista funzionale le linee tumorali WT e le POSTN-KO sono state confrontate in termini di: • capacità proliferativa delle linee tumorali WT e POSTN-KO mediante il monitoraggio del tasso di crescita giornaliero e l’analisi dei livelli di espressione del marker Ki-67; • capacità di formazione di sferoidi per determinare l’impatto di POSTN nella composizione e stabilizzazione della ECM; • vitalità cellulare in serum starvation per valutare il ruolo di POSTN nella sopravvivenza delle cellule in condizioni di stress metabolico; I risultati ottenuti dimostrano che il KO di POSTN riduce la capacità proliferativa, aumenta l’area degli sferoidi, suggerendo una struttura meno organizzata dovuta alla destabilizzazione dell’ECM e riduce la sopravvivenza cellulare in condizioni di stress metabolico. In conclusione, i dati prodotti in questo studio suggeriscono che POSTN potrebbe rappresentare un promettente bersaglio molecolare. Interferire con il ruolo biologico che questa proteina svolge nel PDAC permetterebbe di indebolire la cooperazione tra stroma e tumore ed aumentare la sensibilità di questa neoplasia alle terapie.