Sviluppo di una piattaforma integrata basata su colture in bioreattore e 3D bioprinting per la generazione di modelli avanzati di Adenocarcinoma Duttale Pancreatico applicati allo studio dell’efficacia di terapie cellulari con MSC-sTRAIL

L'Adenocarcinoma Duttale Pancreatico (PDAC) è caratterizzato da un’importante reazione desmoplastica e da un microambiente tumorale (TME) dominato dai Cancer-Associated Fibroblasts (CAF), cellule stromali di supporto che conferiscono chemioresistenza e ostacolano l'efficacia dei trattamenti. I tradizionali modelli in vitro 2D risultano inadeguati per replicare la complessità del TME, rendendo necessario lo sviluppo di strutture 3D per migliorare lo screening di terapie avanzate. Lo scopo del presente studio è stato generare e validare due diversi modelli 3D avanzati di PDAC, basati sulla co-coltura di cellule tumorali e CAF, affiancando piattaforme bioingegneristiche di nuova generazione rappresentate dal bioreattore VITVO e dalla tecnologia del 3D bioprinting. Questi modelli 3D sono stati utilizzati per valutare l'efficacia antitumorale di terapie cellulari a base di Cellule Staminali Mesenchimali (MSC) ingegnerizzate per il rilascio della molecola pro-apoptotica soluble TRAIL (s-TRAIL). Le colture primarie di CAF e la linea tumorale BxPC-3 Luc+ sono state ingegnerizzate mediante trasduzione con vettori retrovirali per esprimere stabilmente i fluorofori GFP e mScarlet. Successivamente, il mantenimento della sensibilità farmacologica della linea BxPC-3 mScarlet è stato validato mediante saggio dose-risposta con s-TRAIL in 2D. Per la valutazione terapeutica in ambiente tridimensionale, è stata allestita una co-coltura cellulare (BxPC-3 e CAF) all'interno del bioreattore VITVO, successivamente trattata con MSC sTRAIL e MSC wild-type (WT) in rapporto 1:1. Parallelamente, è stato ottimizzato un modello di PDAC stampato in 3D tramite miniaturizzazione della geometria di stampa per incrementare la resa dei replicati. La maturazione morfologica del costrutto è stata studiata ai timepoint di 6, 13 e 20 giorni tramite acquisizione mediante microscopia confocale e analisi con il software ImageJ per l'estrazione di parametri morfologici e di fluorescenza. In seguito, i costrutti 3D sono stati sottoposti a due regimi di trattamento: esposizione a concentrazioni scalari di sTRAIL, derivato da surnatante di MSC, e co-coltura diretta con MSC sTRAIL (rapporto 1:1), la cui semina è stata precedentemente studiata su scaffold acellulari di controllo. L'efficacia pro-apoptotica è stata quantificata mediante microscopia confocale, analisi istologiche e citofluorimetria. Le piattaforme 3D impiegate rappresentano meglio la complessità del TME pancreatico, replicando la resistenza terapeutica e confermando la limitatezza dei convenzionali saggi bidimensionali. Il trattamento in co-coltura con MSC sTRAIL ha dimostrato una marcata attività pro-apoptotica a carico della componente tumorale, visualizzata mediante microscopia confocale e confermata quantitativamente al timepoint finale tramite analisi 2 citofluorimetrica. Al contrario, la somministrazione esclusiva di sTRAIL non ha prodotto un'efficacia pro-apoptotica evidente. Questa discrepanza nella risposta terapeutica suggerisce che la barriera desmoplastica ricreata nel modello 3D stampato, come descritto in letteratura, possa aver mediato un’azione protettiva sul compartimento tumorale: limitando fisicamente la diffusione di sTRAIL e favorendo l'attivazione di pathway antiapoptotici e pro-survival, che saranno oggetto di approfondimento in studi futuri. I risultati ottenuti mostrano forti indicazioni che le piattaforme 3D utilizzate possano mimare più fedelmente la complessità tumorale che si ritrova in vivo e quindi essere utilizzate come strumenti preclinici predittivi ed essenziali per lo screening di terapie oncologiche avanzate nel PDAC. Inoltre, questi modelli offrono un'alternativa in vitro in grado di limitare il ricorso ai modelli animali, rispettando il principio etico delle 3R (Replacement, Reduction, Refinement).