Ruolo dell'asse PD-L1/IL-6 nella regolazione della risposta immunitaria nella colangite sclerosante primitiva (PSC)

La colangite sclerosante primitiva (PSC) è una colangiopatia cronica immunomediata, caratterizzata da un progressivo stato infiammatorio che colpisce i dotti biliari intra- ed extra-epatici. Sebbene la sua patogenesi non sia ancora del tutto nota, alterazioni sostanziali si verificano a carico della parete duttale, dove la presenza di un persistente ambiente pro-infiammatorio determina il danno dei colangiociti (Biliary Epithelial Cells, BECs), le cellule epiteliali che rivestono il lume dei dotti biliari. Tale condizione oltre a favorire la fibrosi e conseguente stenosi biliare, rappresenta un fattore predisponente la progressione a colangiocarcinoma (CCA). Nella PSC, il danno cronico dell’epitelio biliare determina un’attivazione delle BECs, caratterizzata da un aumento della proliferazione e della secrezione di citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-6, che contribuiscono al mantenimento e amplificazione del microambiente infiammatorio. Studi recenti condotti su campioni di pazienti affetti da PSC hanno evidenziato come le BECs regolino l'immunità epatobiliare attraverso pathways immunomodulatori, tra cui l’asse PD-1/PD-L1. La presenza di uno stato immunosoppressivo è stata confermata dall’espressione di PD-1 e dall’aumento dell’apoptosi nelle cellule immunitarie infiltranti CD45+. Alla luce di queste evidenze, il presente progetto di tesi ha analizzato il ruolo del pathway PD-1/PD-L1 nella modulazione della risposta immunitaria della PSC. A tal fine, è stato riprodotto un microambiente infiammatorio in vitro utilizzando human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) ottenute da soggetti sani (n=3) e attivate per CD3 e CD28 (aPBMCs). In seguito, sono state allestite co-colture indirette mediante l’uso di transwell tra BECs e aPBMCs. L’analisi trascrittomica mediante Nanostring nCounter® ha identificato nelle BECs sottoposte a co-coltura, 68 geni differenzialmente espressi (DEGs), con un arricchimento significativo dei geni coinvolti nei pathways di PD-1/PD-L1 e IL-6/JAK/STAT3, dati successivamente confermati a livello proteico mediante analisi di western blot e immunofluorescenza confocale. Parallelamente, sono stati condotti esperimenti di citofluorimetria volti a valutare l’apoptosi delle cellule immunitarie, in particolare delle cellule T CD4+, CD8+ e delle cellule Natural Killer (NK). I risultati ottenuti indicano un aumento dell’apoptosi dei leucociti in seguito a co-coltura, effetto che viene parzialmente revertito in presenza di un anticorpo anti-PD-1. L’analisi dei surnatanti delle co-colture ha inoltre evidenziato una diminuzione delle principali citochine pro-infiammatorie, quali TNF-α, IL-1β e IL-8, ad eccezione di IL-6, i cui livelli aumentano in seguito a co-cultura. Pertanto, è stata valutata la correlazione tra i pathways di IL-6/JAK/STAT3 e PD-1/PD-L1 nelle BECs esposte al microambiente infiammatorio. Esperimenti di stimolazione e inibizione del signalling di IL-6 mediante l’uso del complesso IL-6/sIL-6r e di inibitori specifici, hanno confermato il ruolo di IL-6 nel sostenere l’espressione di PD-L1 favorendo un fenotipo immunosoppressivo nelle BECs. In conclusione, i risultati ottenuti hanno evidenziato il cross-talk molecolare tra il pathway infiammatorio di IL-6 e i meccanismi di immunomodulazione mediati da PD-L1, offrendo nuove prospettive di studio nella patogenesi della PSC e nell’identificazione di nuovi potenziali targets terapeutici.