Analisi del ruolo svolto dallo stress osmotico nel differenziamento osteoclastico indotto da Magnesio Cloruro.

Osteoclastogenesis is the process by which precursors of the monocyte-macrophage lineage differentiate into mature osteoclasts, multinucleated cells specialized in bone resorption. The regulation of this process is essential for maintaining skeletal homeostasis, and alterations in osteoclast activity may contribute to the development of several bone diseases. Among these, osteonecrosis of the jaw represents a relevant complication associated with the use of anti-resorptive drugs, in which the inhibition of osteoclast activity impairs normal bone remodeling. In recent years, magnesium has attracted increasing interest due to its ability to modulate osteoclast differentiation in vitro. However, the use of supra-physiological concentrations of magnesium salts also leads to an increase in the osmolarity of the culture medium. For this reason, it is still not completely clear whether the observed effect is specifically due to Mg²⁺ ions or to the osmotic stress generated by the treatment. The aim of this thesis was to evaluate the relative contribution of magnesium and osmolarity to the differentiation of cells belonging to the monocyte-macrophage lineage. To this purpose, U937 cells, differentiated with PMA and vitamin D3, and THP-1 cells, differentiated with PMA, M-CSF and RANK-L, were used. Cells were analyzed under four experimental conditions: control, hyperosmolar MgCl₂, isoosmolar MgCl₂ and hyperosmolar NaCl. This experimental design made it possible to compare the effect of magnesium in the presence or absence of increased osmolarity, and to evaluate in parallel the effect of a different hyperosmolar solute. In U937 cells, live images were acquired using an inverted microscope, and the expression of monocyte-macrophage and osteoclast markers was evaluated by qRT-PCR. Morphological analysis showed changes compatible with increased differentiation, especially under hyperosmolar conditions. At the molecular level, the monocyte-macrophage markers MAFB, CD14 and CD163 were modulated by the treatments, with a more evident effect under hyperosmolar conditions but, for some markers, also in the presence of isoosmolar MgCl₂. Osteoclast markers, including NFATC1, ACP5/TRAP, CTSK and MMP9, showed a more marked increase in samples treated with hyperosmolar MgCl₂ and hyperosmolar NaCl, whereas isoosmolar MgCl₂ produced more limited effects. In THP-1 cells, morphological analysis was combined with flow cytometric evaluation of CD14 expression. Also in this model, treatment with hyperosmolar MgCl₂ increased CD14 expression, suggesting a possible role of magnesium in monocyte-macrophage maturation. Overall, these results indicate that the pro-differentiating effect of MgCl₂ cannot be attributed exclusively to Mg²⁺ ions but appears to be strongly influenced by the osmotic component. However, the response of some monocyte-macrophage markers suggests that magnesium may also retain a specific biological effect, especially in the earlier or more general phases of cell differentiation. These data contribute to clarifying the role of magnesium in osteoclastogenesis in vitro and may provide useful indications for future studies aimed at locally modulating bone remodeling, also in the context of osteonecrosis of the jaw.

L’osteoclastogenesi è il processo attraverso il quale precursori della linea monocito-macrofagica si differenziano in osteoclasti maturi, cellule multinucleate specializzate nel riassorbimento del tessuto osseo. La regolazione di questo processo è fondamentale per il mantenimento dell’omeostasi scheletrica e alterazioni dell’attività osteoclastica possono contribuire allo sviluppo di diverse patologie ossee. Tra queste, l’osteonecrosi del mascellare rappresenta una complicanza rilevante associata all’impiego di farmaci anti-riassorbitivi, nei quali l’inibizione dell’attività osteoclastica compromette il normale rimodellamento osseo. Negli ultimi anni il magnesio ha suscitato crescente interesse per la sua capacità di modulare il differenziamento osteoclastico in vitro. Tuttavia, l’utilizzo di concentrazioni sopra-fisiologiche di sali di magnesio determina anche un aumento dell’osmolarità del mezzo di coltura. Per questo motivo, non è ancora completamente chiaro se l’effetto osservato sia dovuto specificamente allo ione Mg²⁺ oppure alla condizione di stress osmotico generata dal trattamento. Lo scopo di questa tesi è stato valutare il contributo relativo del magnesio e dell’osmolarità nel differenziamento di cellule della linea monocito-macrofagica. A tale scopo sono state utilizzate cellule U937, differenziate mediante PMA e vitamina D3, e cellule THP-1, differenziate mediante PMA, M-CSF e RANK-L. Le cellule sono state analizzate in quattro condizioni sperimentali: controllo, MgCl₂ iperosmolare, MgCl₂ isosmolare e NaCl iperosmolare. Questo disegno sperimentale ha permesso di confrontare l’effetto del magnesio in presenza o assenza di aumento dell’osmolarità e di valutare parallelamente l’effetto di un diverso soluto iperosmolare. Nelle cellule U937 sono state acquisite immagini al microscopio invertito ed è stata valutata, mediante qRT-PCR, l’espressione di marker monocito-macrofagici e osteoclastici. L’analisi morfologica ha mostrato modificazioni compatibili con un aumento del differenziamento soprattutto nelle condizioni iperosmolari. A livello molecolare, i marker monocito-macrofagici MAFB, CD14 e CD163 sono risultati modulati dai trattamenti, con un effetto più evidente nelle condizioni iperosmolari ma presente, per alcuni marker, anche in presenza di MgCl₂ isosmolare. I marker osteoclastici NFATC1, ACP5/TRAP, CTSK e MMP9 hanno mostrato invece un aumento più marcato nei campioni trattati con MgCl₂ iperosmolare e NaCl iperosmolare, mentre il MgCl₂ isosmolare ha prodotto effetti più limitati. Nelle cellule THP-1, l’analisi morfologica è stata affiancata allo studio citofluorimetrico dell’espressione di CD14. Anche in questo modello il trattamento con MgCl₂ iperosmolare ha determinato un aumento dell’espressione di CD14, suggerendo una possibile azione del magnesio sulla maturazione monocito-macrofagica. Nel complesso, i risultati ottenuti indicano che l’effetto pro-differenziativo del MgCl₂ non può essere attribuito esclusivamente allo ione Mg²⁺, ma appare fortemente influenzato dalla componente osmotica. Tuttavia, la risposta di alcuni marker monocito-macrofagici suggerisce che il magnesio possa mantenere anche un effetto biologico specifico, soprattutto nelle fasi più precoci o generali del differenziamento cellulare. Questi dati contribuiscono a chiarire il ruolo del magnesio nell’osteoclastogenesi in vitro e possono fornire indicazioni utili per futuri studi rivolti alla modulazione locale del rimodellamento osseo, anche nel contesto dell’osteonecrosi del mascellare.